STTM干擾煙草內(nèi)源miRNAs體系的建立.pdf

1、microRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA分子，屬于小RNA（Small RNA）當(dāng)中的一種，它是由前體RNA經(jīng)過(guò)一系列酶切割而來(lái)的，主要負(fù)責(zé)調(diào)控轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)?，F(xiàn)在對(duì)microRNA的研究方法主要有miRNA功能缺失突變體、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、正向遺傳學(xué)和高通量測(cè)序等，但這些方法存在效率低、方法靈敏度差和結(jié)果易受體系、操作及環(huán)境影響等缺點(diǎn)。STTM（Short tandem target mimic）短串聯(lián)靶標(biāo)類

2、似物，是人工合成的一段短的目標(biāo)重復(fù)序列，中間有一段核苷酸序列，兩端有兩個(gè)目標(biāo) miRNA結(jié)合位點(diǎn)，它能與目標(biāo) miRNA結(jié)合，從而有效的阻止miRNA與目的基因的結(jié)合，導(dǎo)致目的基因的積累，STTM是用來(lái)研究miRNA功能的最簡(jiǎn)單有效的方法。本文主要在煙草中利用STTM對(duì)一些與抗逆相關(guān)的miRNA（miR398、miR164、miR167、miR169）進(jìn)行研究。
　　主要工作內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面：
　　1、對(duì)STTM398、

3、STTM164、STTM169、STTM167分別設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的片段，將目的片段與載體連接，構(gòu)建了 pZHY807-sttm398、pZHY807-sttm164、pZHY807-sttm167、pZHY807-sttm169和pZHY807-sttm48nt表達(dá)載體。
　　2、用農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，首先確定 Basta篩選壓的濃度，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等過(guò)程長(zhǎng)成植株。
　　3、通過(guò)PCR檢測(cè)

4、來(lái)篩選得到陽(yáng)性植株，一共得到27株陽(yáng)性苗，分別為4株STTM164、6株STTM167、7株STTM169、4株STTM398以及6株STTM48nt，將得到的所有陽(yáng)性植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并將其移栽到土壤中收獲T1代種子。
　　4、對(duì)得到的STTM164、STTM167、STTM169、STTM398、STTM48nt T0代陽(yáng)性植株和野生型植株用20％的PEG進(jìn)行抗旱處理，并檢測(cè)相對(duì)水含量，膜保護(hù)酶活力（SOD和POD）和牛血清蛋

5、白含量等生理生化指標(biāo)，驗(yàn)證miR164、miR169、miR167和miR398的抗旱功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOD在處理3到6天的過(guò)程中總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，STTM164與其他植株相比變化幅度最大，STTM398、STTM164、STTM167、STTM169與STTM48nt和野生型相比均沒(méi)有顯著性差異；POD在處理3到6天的過(guò)程中含量不斷上升，在處理6天之后，STTM164與STTM48nt和野生型相比有顯著性差異；牛血清蛋白含