基于HCR的miRNAs液相芯片檢測體系的建立及S-poly(T)PCR篩選非小細(xì)胞肺癌miRNAs標(biāo)志物的研究.pdf

1、目的：利用S-poly(T) PCR檢測技術(shù)，對非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者血漿miRNAs分階段篩選，旨在獲得對NSCLC具有早期診斷價(jià)值的miRNAs組合，為NSCLC早期診斷提供新的生物學(xué)標(biāo)記。
　　方法：利用S-poly(T) PCR檢測技術(shù)，篩選280例NSCLC患者和277例健康人血漿中特異的miRNAs。第一步，我們將126例Ⅰ期NSCLC患者血漿、154例Ⅱ~Ⅳ期NSCLC患者血漿、277例正常人血漿，各混合為一

2、份，檢測486個(gè)miRNAs的表達(dá)，篩選出在Ⅰ期或Ⅱ~Ⅳ期NSCLC患者血漿中有差異表達(dá)的126個(gè)miRNAs。第二步，將92例腺癌Ⅰ期患者血漿、108例腺癌Ⅱ~Ⅳ期患者血漿，以及34例鱗癌Ⅰ期患者血漿、46例鱗癌Ⅱ~Ⅳ期患者血漿和277例正常人血漿，各混合為一份。對第一階段篩選出的126種miRNA進(jìn)行檢測，獲得40個(gè)腺癌差異表達(dá)的miRNAs和42個(gè)鱗癌差異表達(dá)的miRNAs。第三步，預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出10個(gè)腺癌特異的miRNAs和9個(gè)鱗

3、癌特異的miRNAs后，利用上述指標(biāo)進(jìn)一步對280例NSCLC患者血漿和277例健康人血漿做單樣本驗(yàn)證，并利用Logistic回歸分析，獲得NSCLC的miRNAs早期診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)對入選診斷標(biāo)準(zhǔn)的miRNAs的表達(dá)情況與患者臨床分期進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：通過三步篩選，并對篩選出的10個(gè)腺癌特異的miRNAs和9個(gè)鱗癌特異的miRNAs進(jìn)行單樣本驗(yàn)證，利用Logistic回歸分析，miR-451a、miR-152-3p、mi

4、R-183-5p、miR-144-3p入選腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)（Cma）；miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p入選鱗癌診斷標(biāo)準(zhǔn)（Cms）。受試者工作曲線（ROC）分析顯示，腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)中的4個(gè)miRNAs的ROC曲線下面積（AUC）為0.592-0.803，靈敏度為35.2-60.2％，特異度為82.2-93.3%；而由miR-451a、miR-152-3p、miR-183-5p、miR-144-3p組合的Cma檢

5、測腺癌的AUC為0.935，靈敏度為79.6%，特異度為97.8%，診斷價(jià)值比任一單基因高。另一方面，miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p診斷鱗癌的AUC為0.515-0.870，靈敏度為41.8-74.7%，特異度為72.2-96.7%；而由這3個(gè)miRNAs組成的鱗癌診斷標(biāo)準(zhǔn)Cms對鱗癌的診斷價(jià)值可提高至AUC0.981，靈敏度92.4%，特異度91.1%。相關(guān)性分析顯示Cma及Cms均與腺癌分期正相關(guān)

6、。
　　結(jié)論：miR-451a、miR-152-3p、miR-183-5p、miR-144-3p聯(lián)合診斷腺癌。miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p聯(lián)合診斷鱗癌，是肺癌早期診斷中具有潛在診斷價(jià)值的新的非侵入性生物標(biāo)志物。
　　目的：由于無細(xì)胞體液臨床樣本中miRNAs含量較低，我們建立了基于鏈雜交反應(yīng)（HCR）信號放大體系的miRNAs液相芯片檢測方法，以解決液相芯片miRNAs檢出限（LOD）較

7、高的問題，為臨床樣本多重miRNAs檢測奠定基礎(chǔ)。
　　方法：我們設(shè)計(jì)了一種新型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針（探針M），它包括一段微球連接序列、一段與目標(biāo)miRNA互補(bǔ)的序列、以及一段可引發(fā)HCR反應(yīng)的序列。探針M變性退火后形成莖-環(huán)二級結(jié)構(gòu)，并首先在體系中被微球被捉。當(dāng)目標(biāo)miRNAs存在時(shí)，體系中相應(yīng)的探針M即打開其發(fā)夾結(jié)構(gòu)，釋放HCR引發(fā)鏈，從而引發(fā)兩個(gè)生物素標(biāo)記的莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA單體（探針1及探針2）發(fā)生一系列的鏈雜交反應(yīng)。隨著反應(yīng)進(jìn)行，

8、生物素被探針帶到微球表面。當(dāng)鏈霉素親和素-藻紅蛋白（SA-PE）被加入體系后，各微球表面即可富集到大量的熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)信號放大。檢測時(shí)，Luminex儀器可同時(shí)識別微球的顏色和熒光強(qiáng)度，從而對樣本中的miRNAs進(jìn)行定性及定量分析。
　　結(jié)果：研究結(jié)果表明，HCR信號放大策略的加入使let-7a的定量限降低到了0.1pM，靈敏度是傳統(tǒng)液相芯片的10倍。另外，本方法還能以較高的特異性區(qū)分不同miRNAs的序列差異，并可成功運(yùn)用于