副豬嗜血桿菌毒力因子篩選和capD基因功能研究及致腦膜炎大腸桿菌突破血腦屏障的分子機(jī)制研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis,HPS）是定居在豬群上呼吸道的一種革蘭氏陰性菌，但在特定的條件下如應(yīng)激、免疫力低下和混合感染時(shí)，毒力菌株可以侵入宿主深部組織引起嚴(yán)重的革拉瑟氏病，主要表現(xiàn)為多發(fā)性的漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，是臨床上危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原菌之一。對(duì)該病原的研究起步晚，且缺乏完善的遺傳操作系統(tǒng)，導(dǎo)致目前HPS的毒力因子及其分子致病機(jī)制并不十分的清楚，給防制該病以及發(fā)展有效的新型疫苗帶來了一定的困難。

2、　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們從臨床上選擇了兩株HPS分離株（血清5型菌株SH0165和4型菌株7140），并通過動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在致病力上的顯著差異。通過兩者基因組間的消減雜交，以及對(duì)消減文庫(kù)的PCR篩選和斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證，最終鑒定出了33個(gè)在強(qiáng)毒菌株SH0165中存在而在弱毒菌株7140中不存在的差異片段。這33個(gè)差異片段依據(jù)其對(duì)應(yīng)序列的功能注釋可以分為8大類，分別是sclB基因家族，限制修飾系統(tǒng)，噬菌體相關(guān)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，外膜蛋白類，代謝，D

3、NA合成以及插入序列。隨后，我們對(duì)除噬菌體相關(guān)片段以外的其他21個(gè)差異片段在不同毒力背景的15株HPS參考菌株和42株地方分離株中的流行情況進(jìn)行了調(diào)查并做了統(tǒng)計(jì)分析，最終發(fā)現(xiàn)，sclB4，sclB7，sclB11，nhaC，ABC-typetransportsystem和fhuA這6個(gè)基因在HPS高毒力菌株中的流行情況顯著高于它們?cè)贖PS低毒力菌株中的流行，提示這些差異基因可能與HPS菌株的致病力存在潛在的關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)合其他已有

4、的HPS菌株毒力因子篩選的報(bào)道，我們選擇了HPS菌株的capD基因進(jìn)行后續(xù)基因功能的驗(yàn)證。capD基因編碼一種多糖合成蛋白，該蛋白與創(chuàng)傷弧菌的1型莢膜多糖操縱子中的WbfY蛋白具有52％的氨基酸相似性，提示該基因可能與菌株莢膜的生物學(xué)功能相關(guān)。先前有研究報(bào)道，capD基因?yàn)镠PS強(qiáng)弱毒菌株間的差異基因，在本實(shí)驗(yàn)中通過消減雜交并未篩出該基因，但結(jié)合其他報(bào)道我們?cè)诤罄m(xù)的PCR檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)該capD基因在強(qiáng)毒株SH0165中存在，而在弱毒株71

5、40中不存在，推測(cè)capD基因可能為HPS菌株的一種潛在毒力相關(guān)基因，但該基因在致病中的作用并不清楚。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過構(gòu)建HPS強(qiáng)毒菌株SH0165的capD基因缺失突變株⊿capD以及互補(bǔ)菌株C-capD，直接證實(shí)了該基因與HPS菌株致病力之間的關(guān)系。結(jié)果表明，(1)capD基因的缺失導(dǎo)致HPS菌株對(duì)本動(dòng)物豬的致病力顯著降低，而將該基因互補(bǔ)之后其致病力明顯得到提升;(2)野生株SH0165、缺失株⊿capD以及互補(bǔ)菌株C-capD感

6、染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，野生株SH0165和互補(bǔ)菌株C-capD可以有效地侵入機(jī)體各組織造成多系統(tǒng)感染，同時(shí)從這些組織中可以成功地分離到細(xì)菌，而缺失株⊿capD無(wú)法造成多組織的感染，也不能分到菌，提示capD缺失后菌株向組織侵襲力的降低;(3)capD缺失后，HPS菌株對(duì)血清中補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌作用的抵抗力完全喪失，而該血清抗性在capD互補(bǔ)之后明顯的恢復(fù)。綜合以上結(jié)果表明，capD基因通過影響菌株的血清抗性繼而參與菌株的致病過程，為HPS菌株的一種

7、重要的致病因子。然而，本實(shí)驗(yàn)中通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)capD基因可能僅與莢膜中多糖的結(jié)構(gòu)相關(guān)，而與菌株莢膜形成的有無(wú)并無(wú)直接關(guān)聯(lián)，提示CapD蛋白參與菌株的血清抗性和致病可能與菌株的莢膜關(guān)聯(lián)不大。我們隨后通過蛋白質(zhì)組雙向電泳進(jìn)一步尋找在capD缺失前后菌株蛋白水平上的差異，并鑒定出18個(gè)capD基因缺失后上調(diào)的蛋白和18個(gè)下調(diào)的蛋白。后續(xù)對(duì)這些差異蛋白功能的進(jìn)一步分析將有助于我們更好地理解CapD蛋白與這些蛋白間可能的互作情況，以及它們與

8、HPS菌株致病力的具體關(guān)系。
　　另外，由細(xì)菌感染引發(fā)的腦膜炎一直是造成高死亡率的重要誘因之一，也是目前臨床上急需得到控制的感染病癥。HPS感染后的典型特征之一就是腦膜炎的發(fā)生，有文獻(xiàn)報(bào)道，HPS毒力菌株可以有效地穿過腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，繼而突破血腦屏障(Blood-brainbarrier,BBB)引起腦膜炎。但HPS侵入BBB這一過程的具體分子機(jī)制目前完全未知，一些與腦膜炎感染相關(guān)的分子靶標(biāo)尚有待于逐步的發(fā)掘。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于細(xì)菌性

9、腦膜炎的研究由于實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的不夠完善以及腦組織細(xì)胞來源受限而未能較好的開展，本研究與國(guó)外腦膜炎致病機(jī)制研究團(tuán)隊(duì)合作，以引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)感染最為常見的病原菌大腸桿菌（Escherichiacoli)K1菌株作為代表菌株，探索在致腦膜炎菌株突破BBB致病過程中的重要分子靶標(biāo)。
　　在本研究中，我們首次直接證明了細(xì)胞中的一磷酸鞘氨醇（Sphingosine1-phosphate，S1P）和表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermalgr

10、owthfactorreceptor,EGFR)在致腦膜炎E.coliK1菌株RS218突破BBB過程中的重要功能。RS218菌株感染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）可以激活SphK2/S1P/S1P2信號(hào)途徑，繼而引起由HB-EGF介導(dǎo)的EGFR的激活，具體體現(xiàn)在如下:(1)RS218菌株在侵入HBMEC時(shí)可以激活EGFR，且EGFR抑制劑gefitinib處理細(xì)胞以及通過EGFR顯性突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞均可以導(dǎo)致菌株侵入水平的顯著降低

11、。此外，小鼠經(jīng)gefitinib給藥后可以顯著地抑制RS218菌株對(duì)腦組織的感染;(2)RS218菌株侵入HBMEC可以激活鞘氨醇激酶SphK2，且利用SphK2抑制劑和S1P的受體拮抗劑阻斷細(xì)胞S1P信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑可以有效抑制RS218菌株對(duì)HBMEC的侵入。同時(shí)，小鼠SphK2基因敲除后，感染菌株隨血液循環(huán)進(jìn)入腦組織的數(shù)量也顯著下降;(3)相同的E.coli菌體蛋白OmpA、FimH和N1pI同時(shí)參與菌株在感染時(shí)對(duì)細(xì)胞EGFR的激活、

12、S1P的產(chǎn)生以及SphK2的激活;(4)RS218侵入HBMEC過程中，SphK2/S1P/S1P2信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑為EGFR激活的上游信號(hào)，且通過HB-EGF介導(dǎo)EGFR的激活;(5)SphK2/S1P/S1P2-EGFR信號(hào)途徑通過激活c-Src以及后續(xù)的ERM蛋白，從而促進(jìn)菌株突破BBB。以上結(jié)果表明，S1P和EGFR在腦膜炎菌株RS218突破BBB引發(fā)CNS感染過程中是兩種十分關(guān)鍵的分子靶標(biāo)，細(xì)菌通過激活這兩種信號(hào)分子從而有助于自身