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文檔簡介
1、鯰愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)是一種兼性的胞內(nèi)寄生菌,為革蘭氏陰性,屬于腸桿菌科,可導致斑點叉尾鮰腸道敗血病,在我國可引起鯰形目魚類的疾病,如黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)頭部的“一點紅”或“頭穿孔”。
本研究通過對分離自患病黃顙魚的鯰愛德華氏菌HSN-1株自帶的兩個質(zhì)粒pEI1和pEI2序列的測定,發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白中有與Ⅲ型分泌系統(tǒng)(typeⅢ secretion s
2、ystem,T3SS)同源的分子。本研究對質(zhì)粒編碼的EseH、EseI和EscD進行了在宿主細胞的定位及其致病性方面的研究。通過測序,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pEI1不含轉(zhuǎn)座子,其編碼的EseH和pEI2編碼的EscD和EseI分別與T3SS蛋白有一定程度的相似性,其中EseH和EscD分別具有T3SS超家族PRK15372和PRK15336的保守結(jié)構(gòu)域。而EseI在C-端與T3SS效應(yīng)分子OspB有較低程度的相似性,因此推測這3個蛋白可能與鯰愛德華氏
3、菌的致病性相關(guān)。由于pEI1和pEI2為多拷貝質(zhì)粒,本研究利用同源質(zhì)粒不相容原理對兩個質(zhì)粒分別進行徹底消除以構(gòu)建目的基因缺失突變株,并檢測了突變株對黃顙魚的半數(shù)致死量(LD50)和體內(nèi)競爭感染系數(shù)(Competitive Index,CI)。野生型HSN-1的LD50為105.4775(R2=0.9945),突變株ΔeseH和ΔeseI的LD50比野生型略高,分別為105.6567和105.8758,而ΔescD的LD50與HSN-1的
4、LD50差別較小,為105.5497。ΔeseH和ΔeseI的CI在肝臟分別為0.7246和0.6373,在脾臟為0.7044和0.6158,均顯著低于野生型(P<0.01),而ΔescD的CI則超過1.5,顯著高于野生型(P<0.01)。用突變株感染鯉上皮瘤細胞(EPC),發(fā)現(xiàn)ΔeseH,ΔeseI以及pEI1-pEI2-與野生型相比其對EPC的粘附力降低,而ΔeseI和pEI1-pEI2-的侵襲能力則明顯增強。比較突變株和野生型在黃
5、顙魚頭腎巨噬細胞的繁殖,發(fā)現(xiàn)ΔeseH的繁殖力降低,ΔeseI在巨噬細胞內(nèi)的繁殖受到抑制,最終被巨噬細胞清除,而ΔescD與HSN-1的差異不顯著(P>0.05)。由于鯰愛德華氏菌與遲緩愛德華氏菌在T3SS的分子組成和基因排列方面都比較相似,本研究利用遲緩愛德華氏菌的T3SS檢測這3種蛋白是否由該系統(tǒng)所分泌和轉(zhuǎn)運。研究發(fā)現(xiàn)EseH和EseI可被分泌并轉(zhuǎn)運進宿主細胞,EseH的分泌依賴轉(zhuǎn)運相關(guān)的T3SS,而EseI則不依賴T3SS;被轉(zhuǎn)運
6、進入ZF4宿主細胞的EseH分布于細胞核外,定位于細胞的膜相,EseI定位于胞漿質(zhì)相;而EscD不被T3SS所分泌。此外,通過酵母雙雜交實驗,證明EscD與EseH或EseI不存在蛋白與蛋白之間的結(jié)合作用,即EscD不是所報道的EseH或EseI的分子伴侶。
本研究對鯰愛德華氏菌HSN-1株質(zhì)粒pEI1和pEI2的基因組進行了測序,通過構(gòu)建突變株發(fā)現(xiàn)eseH、eseI和escD皆為毒力基因,與細菌的粘附、侵襲及在魚類細胞或
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