蛋氨酸源甲基供體對意大利蜜蜂級(jí)型分化的影響.pdf

1、昆蟲的多型性現(xiàn)象是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果，其中一種典型的表現(xiàn)形式就是蜜蜂的級(jí)型分化。蜜蜂級(jí)型分化的機(jī)理一直以來都是蜜蜂發(fā)育生物學(xué)中備受爭議的問題。有研究表明，DNA甲基化對蜜蜂的級(jí)型分化有重要的作用。蛋氨酸作為一種重要的食源性甲基供體，在蜜蜂級(jí)型分化中的作用仍無人探究。
　　本研究擬將蛋氨酸作為意大利蜜蜂幼蟲甲基供體的食物來源展開研究，探索蛋氨酸源甲基供體對意大利蜜蜂級(jí)型分化的影響。分三個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行：首先，確定蜂王與工蜂幼蟲體內(nèi)甲

2、基供體S-腺苷蛋氨酸（SAM）合成與代謝的差異，為探索DNA甲基化與蜜蜂級(jí)型分化的關(guān)系提供理論依據(jù)；在此基礎(chǔ)上，利用蛋氨酸及去甲基化試劑，從正、反兩個(gè)方向具體驗(yàn)證蛋氨酸源甲基供體對DNA甲基化的影響；DNA甲基化的進(jìn)行需要能量三磷酸腺苷（ATP）的參與，而ATP主要由單糖通過三羧酸循環(huán)提供，所以最后，研究蛋氨酸與單糖協(xié)同對意大利蜜蜂級(jí)型分化的影響，最終確定蛋氨酸作為一種食源性甲基供體與單糖協(xié)同對意大利蜜蜂級(jí)型分化的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)

3、果如下：
　　試驗(yàn)一.蜂王與工蜂幼蟲體內(nèi)甲基供體SAM合成與代謝的差異研究。試驗(yàn)選用分別來自5群姐妹蜂王群新出房的1 d意大利蜜蜂幼蟲890只，分為兩組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)89只。其中第1組組織人工育王，第2組自然發(fā)育成工蜂。取3d、4d和5d的蜂王與工蜂的幼蟲，測定其體內(nèi)SAM合成與代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)及其酶活的差異。
　　結(jié)果表明：
　?。?）蜂王幼蟲的SAM含量隨日齡的增加變化不顯著（P＞0.05）而工蜂幼蟲

4、的隨日齡增而升高（P＜0.05）。
　　（2）蜂王幼蟲SAMS表達(dá)量隨日齡增加而下降（P＜0.01），而工蜂幼蟲SAMS表達(dá)量隨日齡變化不顯著（P＞0.05）；
　?。?）蜂王幼蟲的Dnmt1a表達(dá)量隨日齡增加無顯著變化（P＞0.05），但其酶活隨日齡增加而下降（P＜0.05）；工蜂幼蟲Dnmt1a表達(dá)量隨日齡增加而下降（P＞0.05），但其酶活隨日齡增加而上升（P＜0.01）；
　?。?）蜂王幼蟲Dnmt3表達(dá)量隨日

5、齡增加而下降（P＜0.05），而工蜂幼蟲變化不顯著；工蜂幼蟲Dnmt3酶活性隨日齡變化顯著（P＜0.05），而蜂王幼蟲變化不顯著（P＞0.05）。本試驗(yàn)表明：3—5日齡意大利蜜蜂蜂王幼蟲與工蜂幼蟲體內(nèi)的活性甲基供體SAM的合成與代謝存在差異，4日齡前SAM參與DNA維持甲基化的代謝過程，蜂王幼蟲比工蜂活躍，4日齡后工蜂幼蟲比蜂王幼蟲活躍；在3—5日齡期間，蜂王幼蟲SAM參與DNA從頭甲基化的代謝過程逐漸減弱，工蜂幼蟲維持不變，但該代謝過

6、程在蜂王幼蟲體內(nèi)始終不低于工蜂幼蟲。
　　試驗(yàn)二.蛋氨酸源甲基供體對意大利蜜蜂級(jí)型分化的影響。試驗(yàn)選用1d意大利蜜蜂幼蟲360只，平均分為3組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)24只。試驗(yàn)中第1組：幼蟲階段全部飼喂基礎(chǔ)日糧；第2組：1d-2d飼喂基礎(chǔ)日糧，2d以后飼喂添加了蛋氨酸的日糧；第3組：1d-2d飼喂基礎(chǔ)日糧，2d-3d飼喂添加了蛋氨酸的日糧，3d及以后飼喂添加了去甲基化試劑5-氮雜胞嘧啶核苷（5-Azacytidine）的日糧。<

7、br>　　結(jié)果表明：
　　（1）飼糧中單純添加了蛋氨酸之后，幼蟲化蛹率和羽化率都會(huì)升高，且差異顯著（P＜0.05），而添加了5-氮雜胞嘧啶核苷（5-Azacytidine）之后幼蟲的化蛹率和羽化率都會(huì)降低，且差異顯著（P＜0.05）。
　?。?）飼糧中添加了5-氮雜胞嘧啶核苷（5-Azacytidine）之后，幼蟲化蛹出房后的成蜂卵巢小管數(shù)顯著增加(P＜0.0001），成蜂體長也是同樣趨勢（P＜0.01）。
　?。?）

8、取5日齡幼蟲測定生理生化指標(biāo)：飼糧中添加了5-氮雜胞嘧啶核苷（5-Azacytidine）之后，幼蟲體內(nèi)SAMS表達(dá)量顯著低于其他組（P＜0.05）；飼糧中添加了5-氮雜胞嘧啶核苷（5-Azacytidine）之后，幼蟲體內(nèi)Dnmt1酶活顯著下降（P＜0.0001）；幼蟲體內(nèi)Dnmt3表達(dá)量顯著低于其他兩組；添加了蛋氨酸之后Dnmt3表達(dá)量高于對照組（P＜0.01）；飼糧中添加了5-氮雜胞嘧啶核苷（5-Azacytidine）之后，Dn

9、mt3酶活顯著高于對照組和蛋氨酸組（P＜0.01）。本試驗(yàn)說明，蛋氨酸源甲基供體會(huì)影響幼蟲化蛹羽化出房后成蜂的卵巢小管的數(shù)量和幼蟲體內(nèi)與甲基化有關(guān)的活性甲基供體SAM的合成與代謝，進(jìn)而影響蜜蜂的級(jí)型分化，使得蜜蜂幼蟲朝著工蜂方向發(fā)育。
　　試驗(yàn)三.蛋氨酸源甲基供體與單糖協(xié)同對意大利蜜蜂級(jí)型分化的影響。試驗(yàn)選用1d意大利蜜蜂幼蟲1480只，平均分為6組，每組5個(gè)重復(fù)。第1組飼喂基礎(chǔ)日糧，第2-6組分別飼喂固定蛋氨酸量為3mg/g，而

10、葡萄糖：果糖分別為為2：3、1：1、4:3、5:3和2：1的日糧。
　　研究結(jié)果表明：
　　（1）飼糧中固定蛋氨酸改變葡萄糖的量之后，葡萄糖：果糖為4:3和5:3時(shí)幼蟲化蛹率最高（P＜0.01）；葡萄糖：果糖為1:1時(shí)，幼蟲羽化率最高，在葡萄糖：果糖為2:3時(shí)，幼蟲羽化率和化蛹率都是最低（P＜0.0001）。
　　（2）飼糧中固定蛋氨酸改變葡萄糖的量之后，葡萄糖：果糖為2:3時(shí)幼蟲化蛹羽化出房后卵巢小管數(shù)最少，繼續(xù)升高

11、葡萄糖的量到葡萄糖：果糖為12:6時(shí)，卵巢小管數(shù)不斷增多，且卵巢小管數(shù)在50-80條及＞90條之間的的成蜂數(shù)量所占總的羽化出房的成蜂數(shù)量比例升高（P＜0.0001）；葡萄糖：果糖為2:3時(shí)幼蟲化蛹羽化出房后成蜂體長最短，葡萄糖：果糖為2:1時(shí)，成蜂的體長最長（P＜0.0001）。
　　（3）飼糧中固定蛋氨酸改變葡萄糖的量之后影響SAM的合成，3日齡時(shí)，葡萄糖：果糖為8:6時(shí)，SAM含量最多（P＜0.01），4日齡時(shí)，在基礎(chǔ)日糧和葡

12、萄糖：果糖為4:6時(shí)幼蟲體內(nèi)SAM含量最多（P＜0.01）；4日齡時(shí)，基礎(chǔ)日糧組和葡萄糖：果糖為12:6時(shí)，SAMS表達(dá)量最多（P＜0.05），5日齡時(shí)，葡萄糖：果糖為10:6時(shí)幼蟲體內(nèi)SAMS表達(dá)量最多（P＜0.05）；
　　（4）飼糧中固定蛋氨酸改變葡萄糖的量之后影響ATP的合成：4日齡時(shí)，葡萄糖：果糖為2:3時(shí)，ATP含量最少，葡萄糖：果糖為1:1和4:3時(shí)，幼蟲體內(nèi)ATP含量最多（P＜0.05）；3日齡時(shí)，飼喂基礎(chǔ)日糧時(shí)，

13、幼蟲體內(nèi)檸檬酸合酶（CS）基因表達(dá)量最小，葡萄糖：果糖為4:6時(shí)和12:6時(shí)，幼蟲體內(nèi)CS表達(dá)量高于其他組（P＜0.05），4日齡時(shí)，隨葡萄糖量的增多，檸檬酸合酶（CS）基因表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）。本試驗(yàn)研究表明，蛋氨酸源甲基供體與單糖協(xié)同作用會(huì)影響幼蟲羽化出房后成蜂卵巢小管的數(shù)量及幼蟲體內(nèi)DNA甲基化代謝相關(guān)酶活與基因表達(dá)量，進(jìn)而影響蜜蜂的級(jí)型分化，即飼糧中添加蛋氨酸及多的單糖，會(huì)使得蜜蜂幼蟲朝著蜂王方向發(fā)育。
　　綜上