脊尾白蝦全人工繁育及繁殖相關(guān)基因的研究.pdf

1、本研究首次解決了脊尾白蝦全人工繁育技術(shù)，提出了人工控制親蝦同步性成熟的方法，以及受精卵人工孵化及幼體選優(yōu)的方法，明確了幼體孵化、培育的適宜溫度和鹽度范圍。同時借助分子生物學手段，克隆了脊尾白蝦卵黃蛋白原(Vg)、卵黃蛋白原受體(VgR)和蛻皮激素受體(EcR)基因，并分析了Vg、VgR和EcR基因在脊尾白蝦繁殖過程中的表達特征。主要結(jié)果如下：
　　一、脊尾白蝦親蝦人工培育
　　1、脊尾白蝦卵巢解剖結(jié)構(gòu)與組織學特征
　　

2、取卵巢發(fā)育不同階段的脊尾白蝦雌蝦卵巢，研究了卵巢結(jié)構(gòu)、組織學特征以及卵黃蛋白積累。結(jié)果顯示，脊尾白蝦卵巢一對，左右對稱，中間分離，前后端愈合，成熟的卵巢外形呈“⊥”型或“橄欖球”型。隨著卵巢發(fā)育，性腺指數(shù)逐漸增大，卵巢成熟時(IV期)最大，排卵后(V期)又降到最??；組織學特征顯示，在卵細胞增殖期，細胞核清晰可見，一般能觀察到1-2個沿核膜內(nèi)側(cè)分布的核仁，同時隨著卵細胞逐漸成熟，卵原細胞周圍的濾泡細胞逐漸增多，卵原細胞的卵黃蛋白逐漸增多。

3、卵細胞成熟時，并未觀察到類似對蝦的皮質(zhì)棒，明顯的標志是細胞核消失，濾泡細胞數(shù)量減少。排卵后的恢復期，細胞核重新出現(xiàn)，卵原細胞又開始增殖，卵黃蛋白重新開始積累。
　　2、脊尾白蝦親蝦人工培育及其同步性成熟調(diào)控方法的建立
　　提出了一種全人工培育脊尾白蝦親蝦的方法，在24℃、26℃溫度下，分別經(jīng)過120天和110天的培育，80％雌蝦性腺可達到成熟。此方法可切斷其病原傳播途徑，在人工控制的養(yǎng)殖環(huán)境下實現(xiàn)脊尾白蝦性腺同步發(fā)育成熟，為

4、培育出健康優(yōu)質(zhì)脊尾白蝦苗種打下良好的基礎(chǔ)。
　　二、脊尾白蝦受精卵人工孵化
　　1、不同溫度和鹽度對脊尾白蝦胚胎發(fā)育速度的影響
　　選用實驗室內(nèi)人工控制交尾的脊尾白蝦，研究了不同溫度和鹽度對脊尾白蝦胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，5-30鹽度范圍內(nèi)，鹽度20時的孵化時間最短，但與5、10、15、25、30鹽度組無顯著差異(P>0.05)。脊尾白蝦胚胎發(fā)育的生物學零度為12.18℃，有效積溫為3828.27℃h。在15-28℃

5、范圍內(nèi)，溫度對脊尾白蝦胚胎發(fā)育影響顯著，胚胎發(fā)育時間隨著溫度升高而呈雙曲線性縮短，而胚胎發(fā)育速度隨著溫度的升高而呈直線性加快，但當溫度超過30℃時，胚胎無法正常完成發(fā)育。因此在脊尾白蝦育苗中，幼體孵化溫度不應(yīng)低于12℃，最高不超過28℃，鹽度控制在5-30范圍內(nèi)即可。
　　2、脊尾白蝦受精卵人工孵化及幼體選優(yōu)方法的建立
　　提出了一種脊尾白蝦人工室內(nèi)孵化及幼體選優(yōu)的方法。主要包括以下特點：通過調(diào)節(jié)水溫，可調(diào)控受精卵發(fā)育速度；

6、可以將活力強幼體與活力差幼體、死亡幼體很好地分離，幼體變態(tài)為仔蝦的存活率在85%以上；每尾抱卵蝦單獨培育，幼體孵化后親緣關(guān)系明確，可用于家系建立及選擇育種。
　　三、脊尾白蝦幼體人工培育
　　1、不同溫度對脊尾白蝦幼體變態(tài)存活的影響
　　選用實驗室內(nèi)人工控制交尾的脊尾白蝦，研究了不同溫度對脊尾白幼體變態(tài)、存活的影響。結(jié)果顯示，在鹽度為31的條件下，脊尾白蝦幼體變態(tài)發(fā)育速度隨著溫度的升高而加快，18℃、20℃、22℃、2

7、4℃、26℃和28℃各實驗組開始出現(xiàn)仔蝦的時間依次為17、14、11、9、8和8 d，各組90%以上幼體變態(tài)為仔蝦的時間依次為21、18、15、14、11和11 d。各實驗組在幼體變態(tài)過程中存活率都呈明顯的階梯式下降趨勢，且28℃組的存活率下降最快，但當存活幼體全部變?yōu)樽形r時，各實驗組間的存活率并無顯著性差異(P>0.05)。18℃組仔蝦干質(zhì)量明顯高于其它各組(P<0.05)，28℃組仔蝦干質(zhì)量最低，但與20℃、22℃、24℃和26℃組

8、無顯著性差異(P>0.05)。因此在脊尾白蝦育苗中，幼體培育溫度，建議控制在22-26℃為最佳。
　　2、不同鹽度對不同日齡脊尾白蝦生長發(fā)育的影響
　　選用室內(nèi)人工培養(yǎng)的卵巢發(fā)育到II期的脊尾白蝦雌蝦以及性成熟雄蝦，經(jīng)逐級淡化，鹽度穩(wěn)定在5、10、15、20、25、30。雌抱卵孵化后，研究了不同鹽度對溞狀幼體變態(tài)、生長及存活的影響，以及不同鹽度對仔蝦后生長、存活的影響。結(jié)果顯示，不同鹽度對脊尾白蝦溞狀幼體的變態(tài)率和存活率無顯

9、著性影響，但對仔蝦的干質(zhì)量影響顯著，15和20鹽度下仔蝦的干質(zhì)量顯著高于其它鹽度組(P<0.05)；不同鹽度對20日齡脊尾白蝦的生長影響顯著(P<0.05)，其特定生長率隨著鹽度升高而逐漸增大，在鹽度20時達到最大(P<0.05)，當鹽度超過20時其特定生長率又開始降低；同時由60日齡脊尾白蝦鰓Na+-K+-ATPase的相對表達量可以看出，在高鹽或低鹽時Na+-K+-ATPase的相對表達量均較高，在鹽度20時鰓Na+-K+-ATPa

10、se的相對表達量最低(P<0.05)，經(jīng)二次方程擬合計算，理論 Na+-K+-ATPase的相對表達量最低時的鹽度為17.53，此鹽度可能為脊尾白蝦成體的等滲點。因此，在脊尾白蝦人工育苗及養(yǎng)殖過程中，建議適宜鹽度控制在15-20。
　　3、不同日齡脊尾白蝦對氨氮的耐受性
　　在水溫24℃、鹽度31、pH8.1的條件下，研究了氨氮對30日齡和120日齡脊尾白蝦的毒性。結(jié)果表明，氨氮對30日齡脊尾白蝦24、48、72、96 h的

11、半致死質(zhì)量濃度分別為155.81、116.71、92.55、80.40 mg/L，氨氮對120日齡脊尾白蝦24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為178.80、156.37、140.28、120.86 mg/L。30日齡脊尾白蝦總氨氮和非離子氨的安全質(zhì)量濃度為8.04、0.26 mg/L，120日齡脊尾白蝦總氨氮和非離子氨的安全質(zhì)量濃度為12.09、0.50 mg/L。因此，在脊尾白蝦養(yǎng)殖過程中，水體中的非離子氨濃度不應(yīng)超過0.

12、26 mg/L。
　　四、脊尾白蝦卵黃蛋白原基因的克隆及其在卵巢發(fā)育過程中的表達分析
　　首次克隆得到了脊尾白蝦卵黃蛋白原基因(Vg)cDNA，全長7841 bp，開放閱讀框7632 bp，編碼2543個氨基酸。脊尾白蝦Vg氨基酸與羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)一致性最高為75%，與高背長額蝦(Pandalus hypsinotus)一致性為62%，與日本仿長額蝦(Pandalopsis ja

13、ponica)為61%，而與對蝦科的對蝦一致性卻相對較低，為33-38%。該蛋白存在7個 N-糖基化位點(N151，N159，N168，N614，N660，N936和 N2306)，而在枝鰓亞目中幾乎沒有糖基化位點。
　　熒光定量分析顯示，脊尾白蝦Vg主要在肝胰腺內(nèi)表達，其次為卵巢，肌肉和鰓有微量的表達。卵巢發(fā)育期間，卵巢中Vg mRNA的相對表達量卻是一直處于上升趨勢，在第V期時達到最大；而肝胰腺中Vg mRNA的相對表達量在I

14、V期時卻最高，在V期的表達量下降至與I、II期水平。但在卵巢整個發(fā)育階段，肝胰腺中Vg mRNA的相對表達量始終顯著高于卵巢(P>0.05)，因此推測，在脊尾白蝦卵巢整個發(fā)育過程中，Vg主要在肝胰腺內(nèi)合成，只是在恢復期時卵巢中的Vg合成明顯起到了協(xié)助作用，為脊尾白蝦卵巢再次成熟奠定了基礎(chǔ)。
　　五、脊尾白蝦卵黃蛋白原受體基因的克隆及其在卵巢發(fā)育過程中表達模式
　　成功獲得了脊尾白蝦卵黃蛋白原受體基因(VgR)cDNA全長，開

15、放閱讀框5661 bp，編碼1886個氨基酸。親緣關(guān)系分析，脊尾白蝦VgR與蝦類的親緣關(guān)系最近，其次為昆蟲，而與魚類等脊椎動物關(guān)系較遠。脊尾白蝦VgR含4種結(jié)構(gòu)域，LDL-receptor class A domain，Low-density lipoprotein-receptor YWTD domain，EGF domain和Transmembrane region，是一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。
　　通過熒光定量PCR對該基因在各組織

16、及卵巢發(fā)育期肝胰腺和卵巢內(nèi)的表達分析顯示，脊尾白蝦VgR在肝胰腺、卵巢、鰓和肌肉中均有表達，但主要在卵巢內(nèi)表達，其次為肝胰腺。在卵巢發(fā)育過程中，卵巢內(nèi)的VgR的表達量呈現(xiàn)先升高后降低又升高趨勢，在III期的表達量顯著高于I、II期(P<0.05)，IV期的表達量最低(P<0.05)，而在V期時表達量達到最大(P<0.05)；隨著卵巢的發(fā)育，肝胰腺內(nèi)VgR的表達量在IV時顯著高于其它時期的表達量(P<0.05)，I和V期的表達量相近(P>

17、0.05)，II和III的表達量最低。在卵巢整個發(fā)育過程中，卵巢內(nèi) VgR的表達量始終顯著高于肝胰腺內(nèi)的表達量(P<0.05)。結(jié)果表明，脊尾白蝦VgR對Vg的轉(zhuǎn)運可能存在一個平衡，即當卵巢成熟時由肝胰腺分泌到血液中的部分Vg被肝胰腺VgR又重新轉(zhuǎn)移至肝胰腺內(nèi)，而為下次卵巢發(fā)育準備，在排卵后的恢復期肝胰腺中VgR表達量的降低和卵巢中VgR表達量的升高也說明，VgR對Vg的轉(zhuǎn)運在不同階段是有方向性的。
　　六、脊尾白蝦蛻皮激素受體基

18、因的克隆及其在卵巢和胚胎發(fā)育中表達分析
　　首次克隆得到了脊尾白蝦蛻皮激素受體(ECR)基因cDNA，全長2638 bp，開放閱讀框1713bp，編碼570個氨基酸。系統(tǒng)進化分析，與已知的甲殼動物ECR親緣關(guān)系最近，而與昆蟲親緣關(guān)系較遠。熒光定量分析顯示，脊尾白蝦ECR除在血細胞中不表達外，在其它各組織器官中均有分布，主要在受精卵和肝胰腺中表達，而在肌肉、卵巢、大額腺和鰓等組織中的表達卻相對較低。
　　卵巢發(fā)育不同階段，肝胰

19、腺中ECR和HSP90的表達量變化與Vg的表達量呈正相關(guān)性，推測在肝胰腺中ECR與HSP90主要參與了Vg的合成；卵巢中ECR與性腺成熟相關(guān)，ECR的表達量在III期達到最高(P<0.05)，而III期是生殖蛻皮前蛻皮激素含量高峰期。
　　脊尾白蝦胚胎發(fā)育過程中，ECR的表達量隨著胚胎發(fā)育呈逐漸上升趨勢，在Zoea I達到最大(P<0.05)；HSP90的表達量隨著胚胎發(fā)育逐漸升高，在前溞狀幼體期(Protozoea)達到最大，而