脊尾白蝦回交家系的遺傳特性及免疫功能研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)屬甲殼綱、十足目、長臂蝦科、白蝦屬,是一種中小型底棲蝦類,近年來成為沿海灘涂地區(qū)重要的特色水產(chǎn)養(yǎng)殖品種?;亟蛔鳛橹匾挠N手段,因其可改變現(xiàn)有品種單個性狀、加速純系的培育而被廣泛應(yīng)用。為鑒定脊尾白蝦回交家系對于良種選育的應(yīng)用價值,本研究開發(fā)了脊尾白蝦31個多態(tài)性微衛(wèi)星位點及49個SNP位點,并利用這些標(biāo)記分析了脊尾白蝦3個回交家系的遺傳規(guī)律,揭示脊尾白蝦回交家系的優(yōu)良性狀及其相關(guān)

2、遺傳機制,為脊尾白蝦的標(biāo)記輔助育種提供參考;首次克隆了脊尾白蝦TRAF6基因cDNA全長,分析了其組織表達(dá)分布,并且研究了感染W(wǎng)SSV后TRAF6基因在脊尾白蝦野生群體和回交家系組織中的表達(dá)特征,探討了脊尾白蝦回交家系與野生群體TRAF6基因免疫表達(dá)的差異。
  1.脊尾白蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及回交家系的遺傳結(jié)構(gòu)分析
  本研究利用脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā),根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列自行設(shè)計了269對微衛(wèi)星引物,篩選出3

3、1個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記,并用30尾野生個體進(jìn)行了驗證,發(fā)現(xiàn)31個位點等位基因數(shù)目(Na)為2-9,平均等位基因數(shù)為4.19,其中微衛(wèi)星標(biāo)記ECL03、ECL27具有最多的等位基因數(shù)(9個);平均觀測雜合度(Ho)為0.5787、平均期望雜合度(He)為0.6535,平均多態(tài)性信息含量(PIC)為0.5821,結(jié)果表明31個位點中有25個表現(xiàn)為高度多態(tài),有6個表現(xiàn)為中度多態(tài)。
  利用上述開發(fā)的25個多態(tài)性較好的微衛(wèi)星標(biāo)記分析了

4、本實驗室構(gòu)建的A、B、C三個回交家系的遺傳結(jié)構(gòu)特征,結(jié)果發(fā)現(xiàn):回交家系A(chǔ)、B、C的平均等位基因數(shù)N分別為2.21、2.18、2.09,觀測雜合度Ho分別為0.3805、0.3703、0.2489,期望雜合度He分別為0.3629、0.3998、0.2503,多態(tài)信息含量PIC分別為0.3257、0.3391、0.2585,相較于野生群體已有了大幅度地降低,屬中度或低度多態(tài);回交家系A(chǔ)、B、C在25個位點上共得到62個等位基因,其中A家系

5、56個,B家系54個,C家系51個,3個回交家系共同存在的等位基因39個,6個位點在回交家系中處于純合狀態(tài)(ECL10在A、B、C中都已純合),計算得出3個回交家系的純合率分別為53.86%、56.53%、63.33%,與野生群體16.91%相比顯著提高,可見回交群體的基因純化速率較快,適用于脊尾白蝦重要經(jīng)濟性狀的遺傳解析和優(yōu)良種質(zhì)的選育。
  2.脊尾白蝦生長性狀相關(guān)SNP的開發(fā)及其對回交家系的遺傳特性分析
  為了發(fā)掘脊

6、尾白蝦與生長性狀相關(guān)的SNP位點,本研究基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),篩選出生長相關(guān)候選基因片段11條,利用該基因序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴增,得到總長為4579 bp的DNA片段,通過直接測序法發(fā)現(xiàn)49個SNP位點,分布頻率為1.07/100bp,其中轉(zhuǎn)換突變的比例為78%,顛換突變的比例為22%,符合“transition bias”原理;通過直接測序法在脊尾白蝦野生群體及回交家系中成功分型了7個SNP位點,通過對SNP位點多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)所有SN

7、P位點并未偏離哈伯溫平衡(HWE),SNP標(biāo)記觀測雜合度(Ho)范圍為0.1667-0.5667,期望雜合度(He)范圍為0.3045-0.5079,上述SNP的MAF遠(yuǎn)大于0.05,說明這些SNP位點的多態(tài)性較高,適合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析;通過多元方差分析進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)2個SNP位點與生長性狀顯著相關(guān)(P<0.05),位點X2-261與體重、體長、腹節(jié)I寬和頭胸甲寬極顯著相關(guān)(P<0.01);9S-111與體重顯著相關(guān)(P<0.05),該

8、結(jié)果有望應(yīng)用于脊尾白蝦的分子標(biāo)記輔助育種研究。
  利用上述7個SNP位點對脊尾白蝦回交家系進(jìn)行了多態(tài)性分析,結(jié)果表明回交家系SNP位點的觀測雜合度(Ho)范圍為0.0333-0.2233,期望雜合度(He)范圍為0.1244-0.3300,與野生群體的雜合度相比都有所降低;7個位點的PIC值較低,這些證明回交家系等位基因的雜合基因型減少,純合基因型增多,使得多態(tài)性降低,這與上述微衛(wèi)星分析的結(jié)果相似。同時,我們發(fā)現(xiàn)同一位點不同回交

9、家系間的雜合度并不一致,而相差較大,這可能與回交家系的父母本基因型有關(guān)。
  3.脊尾白蝦TRAF6(TNF receptor associated factor6)基因的克隆及表達(dá)分析
  首次克隆得到脊尾白蝦TRAF6基因,cDNA全長為2290bp,其開放閱讀框為1698bp,編碼566個氨基酸,其中包括TRAF6所特有的四個結(jié)構(gòu)域,分別為RING型鋅指結(jié)構(gòu)、兩個TRAF型鋅指結(jié)構(gòu)、coiled-coil結(jié)構(gòu)域以及MA

10、TH結(jié)構(gòu)域。同源比對表明,脊尾白蝦TRAF6與斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)和中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)的同源性最高,達(dá)到73%,與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的同源性次之,達(dá)到了72%。利用實時熒光定量PCR分析了TRAF6基因在脊尾白蝦10種組織中的表達(dá)分布,發(fā)現(xiàn)其在10種組織中均有表達(dá),在肝胰腺中表達(dá)最高,而在殼中的表達(dá)量最低,這可能由組織器官功能差異性所致。

11、
  為了研究TRAF6基因在脊尾白蝦野生群體和回交家系免疫防御中的差異。本研究對脊尾白蝦野生群體及回交家系進(jìn)行WSSV感染后,利用實時熒光定量PCR分別檢測了肝胰腺和血細(xì)胞中TRAF6基因在不同時間點的表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果表明,病毒感染后TRAR6基因在肝胰腺和血細(xì)胞中的表達(dá)量在6h后均有明顯的上升趨勢,且在肝胰腺中感染后24 h達(dá)到最高值,血細(xì)胞中感染后12h達(dá)到最高值;對脊尾白蝦野生群體及回交家系TRAR6基因的表達(dá)特征進(jìn)行了

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