糞類(lèi)圓線蟲(chóng)兩個(gè)不同發(fā)育階段microRNA轉(zhuǎn)錄組的鑒定.pdf

1、microRNA(miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度在18-24nt的非編碼RNA。miRNA能通過(guò)與編碼蛋白的mRNA互補(bǔ)或者部分互補(bǔ)從而抑制mRNA的翻譯，對(duì)生物起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控涉及細(xì)胞分化凋亡、生長(zhǎng)發(fā)育和基因表達(dá)等多種重要的生物學(xué)過(guò)程，而且在病毒、植物和動(dòng)物中廣泛的存在。盡管第一個(gè)miRNA(lin-4)在秀麗隱桿線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，其后在其他生物中也相繼發(fā)現(xiàn)了幾百個(gè)miRNAs，其中部分miRNAs的功能也逐漸被闡述，但是目前關(guān)

2、于寄生蟲(chóng)miRNAs鑒定和分子機(jī)制的研究的報(bào)道卻很少。寄生蟲(chóng)生活史復(fù)雜，有的寄生蟲(chóng)從幼蟲(chóng)發(fā)育至成蟲(chóng)甚至要改變多個(gè)宿主，這樣就需要蟲(chóng)體快速地適應(yīng)環(huán)境的變化。而具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的miRNAs很可能在寄生蟲(chóng)的生命活動(dòng)起著重要的調(diào)節(jié)作用。糞類(lèi)圓線蟲(chóng)是一種重要的人畜共患寄生線蟲(chóng)，與大多數(shù)寄生線蟲(chóng)不同，它的生活史包括寄生世代和自由生活世代，因此被認(rèn)為是很好的研究寄生生活的模式動(dòng)物，但目前尚未見(jiàn)到有關(guān)該寄生線蟲(chóng)miRNAs研究的報(bào)道。
　　

3、 本研究通過(guò)對(duì)糞類(lèi)圓線蟲(chóng)的寄生后自由生活一期幼蟲(chóng)和具有感染能力的三期幼蟲(chóng)建立miRNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，鑒定參與糞類(lèi)圓線蟲(chóng)這兩個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的miRNAs并研究其差異表達(dá)。同時(shí)通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)兩個(gè)不同時(shí)期的總miRNAs進(jìn)行靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)。最后，鑒于目前寄生蟲(chóng)中的miRNAs研究較少，選取保守miRNAs利用分子生物學(xué)方法分析其在糞類(lèi)圓線蟲(chóng)兩個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示:
　　 1)糞類(lèi)圓線蟲(chóng)兩個(gè)不同時(shí)期幼蟲(chóng)文庫(kù)的建立和

4、高通量測(cè)序建立了糞類(lèi)圓線蟲(chóng)兩個(gè)不同發(fā)育時(shí)期幼蟲(chóng)的文庫(kù)。高通量測(cè)序后，分別在糞類(lèi)圓線蟲(chóng)的自由生活一期幼蟲(chóng)中獲得了11，154，540 clean reads和1，570，666 uniquereads，具有感染能力的三期蟲(chóng)體中獲得了11，571，267 clean reads和707，106 uniquereads。
　　 2) miRNAs數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析兩個(gè)文庫(kù)中的小RNA分布主要集中在20-24nt;對(duì)小RNA數(shù)據(jù)處理后

5、，糞類(lèi)圓線蟲(chóng)兩個(gè)時(shí)期中共獲得15個(gè)保守miRNAs共17個(gè)miRNA前體、110個(gè)新miRNAs和113個(gè)潛在的miRNAs。在新miRNAs中，自由生活一期幼蟲(chóng)有3個(gè)特異表達(dá)的新miRNA;
　　 靶基因預(yù)測(cè)軟件PicTar對(duì)所有的miRNAs預(yù)測(cè)共得到234個(gè)靶基因，通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)這31個(gè)靶基因功能主要集中在連接、酶促和運(yùn)輸;生物學(xué)過(guò)程分類(lèi)集中在細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程和刺激反饋。比較分析發(fā)現(xiàn):參與生物學(xué)調(diào)節(jié)、定位和色

6、素沉積生物學(xué)過(guò)程的靶基因僅僅在具有感染能力的三期幼蟲(chóng)miRNAs中被預(yù)測(cè)，而與生命發(fā)展和死亡相關(guān)的預(yù)測(cè)靶基因只在寄生后自由生活一起幼蟲(chóng)的miRNAs中發(fā)現(xiàn)。
　　 通過(guò)對(duì)miRBase收錄的物種的所有miRNAs分析顯示，在糞類(lèi)圓線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的15個(gè)保守miRNAs中miR-50、miR-72、miR-86、miR-236和miR-360僅僅在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)。miR-71、miR-79和miR-252在多個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)，而miR-92、

7、miR-124和miR-137基本上存在于miRBase收錄的所有物種中。
　　 3)分子生物學(xué)方法驗(yàn)證糞類(lèi)圓線蟲(chóng)中的miRNAs通過(guò)stemloop-PCR的方法在糞類(lèi)圓線蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)中克隆、測(cè)序了4個(gè)高度表達(dá)的保守miRNAs，測(cè)序結(jié)果顯示在這4個(gè)miRNAs存在三期幼蟲(chóng)中。選取1個(gè)潛在的miRNA(Let-7)和3個(gè)保守miRNAs進(jìn)行熒光定量PCR確定這些miRNAs在糞類(lèi)圓線蟲(chóng)中兩個(gè)不同時(shí)期幼蟲(chóng)中的相對(duì)表達(dá)情況，熒光定量