白藜蘆醇磺丁基醚-β-環(huán)糊精包合物的表征和體外抗腫瘤活性--中文翻譯（節(jié)選）

1、<p>　　白藜蘆醇/磺丁基醚-β-環(huán)糊精包合物的表征和體外抗腫瘤活性</p><p>　　學(xué)者最近的研究熱點(diǎn)是RSV的天然或改性環(huán)糊精的包合物，他們報(bào)導(dǎo)，藥物的水溶性和抗氧化活性增加，尤其當(dāng)它與HP-β-CD包合。據(jù)我們所知RSV與SBE-β-CD包合研究較少，也沒(méi)有包合物的表征研究。</p><p>　　在本試驗(yàn)中，我們制備RSV/SBE-β-CD包合物，環(huán)糊精對(duì)藥物水溶性的

2、影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)冷凍干燥方法制備固體包合物，并用傅里葉變換紅外光譜衰減全反射（FTIR-ATR）幾何圖譜表征了固體狀態(tài)包合物的特點(diǎn)。在溶液中，相溶解度研究和工作曲線法考察包合物的化學(xué)計(jì)量。人乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7）的體外生物測(cè)定法評(píng)估SBE-β-CD對(duì)RSV抗癌活性的影響。</p><p>　　2.2 包合物的制備</p><p>　　SBE-β-CD（200mg）溶解在10ml常溫水

3、并加入超過(guò)其固有溶解度量的RSV。為了防止RSV從反至順位轉(zhuǎn)化，燒杯經(jīng)過(guò)光處理，然后超聲水浴30min，再攪拌3天。然后通過(guò)0.22 m聚四氟乙烯過(guò)濾器過(guò)濾并凍干。</p><p>　　2.3 相溶解度分析</p><p>　　過(guò)量RSV加入含有緩沖溶液的SBE-β-CD（0–8×10?3M）中，水浴15min，密封，避免發(fā)生蒸發(fā)，在25±0.1?C磁力攪拌3天達(dá)到平衡

4、，懸浮液通過(guò)0.22 m聚四氟乙烯的過(guò)濾器過(guò)濾并通過(guò)紫外–可見(jiàn)光譜在200–400 nm范圍分析。這樣做的目的是評(píng)估RSV的溶解量。所有的測(cè)量至少重復(fù)三次。獲得的數(shù)據(jù)可確定RSV與SBE-β-CD結(jié)合常數(shù)。在試驗(yàn)條件下沒(méi)有觀察到RSV降解。</p><p>　　2.4 工作曲線圖法</p><p>　　RSV和SBE-β-CD的等摩爾（1×10?5M）甲醇/水溶液（55 / 45

5、，v/v）混合固定體積的摩爾比從0.1到0.9變化，保持恒定的總摩爾濃度。攪拌1h后，用紫外–可見(jiàn)光譜在305 nm且abs為各溶液的吸光度的變化值。然后，abs×[ RSV ]對(duì)R（R = [RSV] / [RSV] + [ SBE-β-CD ]）繪圖。</p><p>　　2.5 水溶性和溶出度測(cè)定</p><p>　　在3ml水中懸浮過(guò)量的游離的RSV與RSV / SBE

6、-β-CD包合物，25±0.1?C攪拌2天測(cè)定各樣品水溶性。懸浮液通過(guò)0.22 m聚四氟乙烯的過(guò)濾器過(guò)濾且用紫外-可見(jiàn)光譜在305 nm分析。對(duì)同一樣品的溶出率的測(cè)定是根據(jù)美國(guó)藥典第三十二槳法進(jìn)行。330mg游離RSV或?qū)?yīng)量包合物懸浮在900ml水中，在37±0.5?C. 轉(zhuǎn)速100 rpm下，固定的時(shí)間間隔測(cè)定采用紫外可見(jiàn)光譜在305 nm測(cè)定RSV溶液的濃度。用新鮮水補(bǔ)液，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。</p>

7、<p><b>　　2.6。紅外光譜</b></p><p>　　在室溫下使用傅里葉變換紅外（FTIR）光譜儀和熱電冷卻氘化硫酸（DTGS）探測(cè)器，對(duì)紅外光譜進(jìn)行了研究?；谒p全反射（ATR）技術(shù)該粉末被包含在ATR系統(tǒng)，。ATR設(shè)置具有各種優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于普通的吸收裝置。它是無(wú)損的，它只需要微量的樣品，光譜圖顯示良好的信號(hào)-噪聲比，容易避免光譜帶飽和。此外，化學(xué)分析可以直接在A

8、TR光譜進(jìn)行，避免了計(jì)算使用的光學(xué)常數(shù)的必要性。光譜記錄在3800–600cm ?1光譜范圍。為了避免污染，光譜在干燥空氣中收集，與分辨率為4cm?1，平均100重復(fù)掃描，從而保證良好的信噪比和高重現(xiàn)性。</p><p><b>　　2.7 細(xì)胞培養(yǎng)</b></p><p>　　MCF-7細(xì)胞接種于塑料培養(yǎng)皿（100mm×20mm）使用含有谷氨酸，青霉素（1

9、00 IU /ml），鏈霉素（100g/ml）和牛血清（10%，v/v）的細(xì)胞培養(yǎng)基在5% CO2，37?C下孵育，80%融合度時(shí)，加入胰蛋白酶（1ml），1-2min后，等細(xì)胞都變圓后加入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吸到10ml或15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5min，倒掉上清液，用培養(yǎng)基再懸浮，使最終濃度約為7.6×103 cells/cm2。</p><p>　　2.8。細(xì)胞毒性活性

10、評(píng)價(jià)</p><p>　　MTT法進(jìn)行RSV，SBE-β-CD與RSV–SBE-β-CD包合物對(duì)細(xì)胞毒活性測(cè)定，檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢（Z?。‵ormazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能，甲臢晶體的濃度對(duì)細(xì)胞的活性直接相關(guān)。MCF-7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（5×103 / 0.66 cm2），分別在37?C.培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞培

11、養(yǎng)基中加入0.1ml/孔的不同的樣品；未經(jīng)處理的細(xì)胞為對(duì)照?；衔镌诓煌姆跤龝r(shí)間（24，48，和72小時(shí)）的細(xì)胞毒性活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul DMSO /乙醇（1:1，V/V）溶液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，溶解后的甲臢晶體用微孔板分光光度計(jì)在570 nm波長(zhǎng)(690nm校準(zhǔn)

12、)測(cè)量吸光度。</p><p>　　細(xì)胞存活率的百分比計(jì)算根據(jù)以下方程：</p><p>　　細(xì)胞存活率（%）=AbsT /AbsC × 100AbsT為處理細(xì)胞吸收度值，AbsC是對(duì)照（未處理）細(xì)胞吸光度值。。</p><p><b>　　2.9。統(tǒng)計(jì)分析</b></p><p>　　進(jìn)行單因素方差分析，以

13、評(píng)估統(tǒng)計(jì)意義，P＜0.05的值被認(rèn)為差異顯著。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　3.1溶液中包合物的表征</p><p>　　在實(shí)驗(yàn)條件下，排除RSV降解，藥物的水溶液分別存儲(chǔ)在25±0.1?C，在黑暗條件下，在越來(lái)越多SBE-β-CD存在的情況下（RSV：SBE-β-CD摩爾比1:1，1:10，1:50

14、和1:100），紫外-可見(jiàn)光譜觀察結(jié)果。反式RSV顯示了兩個(gè)紫外波段，一個(gè)集中在215 nm附近，另一個(gè)在300 nm左右。后者的光帶在305和316nm處有兩個(gè)小峰。從反式轉(zhuǎn)換為順式RSV 后，300 nm譜帶消失，出現(xiàn)在285 nm波段。環(huán)糊精加入后沒(méi)有觀察到紫外–可見(jiàn)光譜的變化，顯示在實(shí)驗(yàn)條件下RSV沒(méi)有從反式轉(zhuǎn)換為順式（光譜不顯示）。但是越來(lái)越多SBE-β-CD的加入，兩條RSV的吸收強(qiáng)度發(fā)生變化。主要的影響是在兩個(gè)紫外波段：（

15、i）摩爾比小于或等于1:50的，在300 nm左右的吸收帶呈現(xiàn)減色效應(yīng)，在1:100摩爾比時(shí)呈現(xiàn)增色效應(yīng)；（ii）1：1，1:10的摩爾比在215 nm有輕微的增色效應(yīng)；環(huán)糊精濃度較高時(shí)，峰幾乎消失（1:50和1:100）。在215nm邊緣，在所有考察的濃度均紅移約3nm。在紫外–可見(jiàn)光譜呈現(xiàn)變化是由于藥物與輔料，通常伴隨著靜電作用的建立，范德華力和/或氫鍵類型的相互作用。在我</p><p>　　評(píng)價(jià)環(huán)糊精包合

16、化學(xué)分子能力最常見(jiàn)的方法是相溶解度研究。圖3a溶解度圖顯示SBE-β-CD與RSV包合，使藥物溶解度以濃度依賴的方式增加，顯示出良好的主體/客體相互作用。特別是，制得AL型圖，因?yàn)閳D的斜率小于1，包合物的化學(xué)計(jì)量比假設(shè)為1:1在研究的濃度范圍內(nèi)。相溶解度圖從直線部分計(jì)算穩(wěn)定常數(shù)Kc，Kc值是10114M?1。</p><p>　　包合物的化學(xué)計(jì)量是通過(guò)工作曲線證實(shí)，結(jié)合存在SBE-β-CD時(shí)RSV在300 nm波

17、段區(qū)域紫外可見(jiàn)光譜的變化，最大值在R = 0.5且曲線呈現(xiàn)高度對(duì)稱的形狀，證明研究的濃度范圍內(nèi)化學(xué)計(jì)量比為1:1時(shí)包合物存在，在（圖4）。這些結(jié)果與相溶解度研究一致。</p><p>　　包合物強(qiáng)烈增加RSV的水溶性（在25?C時(shí)，未包合RSV與RSV–SBE-β-CD包合物分別為0.03mg/ml和～1.1mg/ml）且呈現(xiàn)出非?？焖俚娜艹觯▓D3b）。</p><p>　　3.2 固態(tài)包

18、合物的表征</p><p>　　FTIR-ATR技術(shù)通過(guò)分析個(gè)別組分和物理混合物在振動(dòng)特征的顯著變化，被應(yīng)用為檢測(cè)固相包合物的形成以及指出主客體不同分子及官能團(tuán)。</p><p>　　RSV，SBE-β-CD，RSV + SBE-β-CD 1:1物理混合物，1:1的包合物的FTIR-ATR光譜是如圖5所示。</p><p>　　RSV的紅外光譜顯示以下主要峰：321

19、4cm?1，游離的O-H伸縮振動(dòng)，在1600和1587cm?1雙波峰，對(duì)應(yīng)芳香苯環(huán)C=C雙鍵和c-c烯烴伸縮振動(dòng)。再次，在1513和1463cm?1反映苯環(huán)骨架振動(dòng)峰。在988和965cm?1峰歸因于不飽和烴基=C-H彎曲振動(dòng)。SBE-β-CD的主要特征是在3700–3000cm?1 O-H強(qiáng)烈伸縮振動(dòng)，在3000–2800cm?1區(qū)出現(xiàn)-CH、-CH2-基團(tuán)重疊的伸縮振動(dòng),在1148和1016cm?1吸收峰分別為C-H和C-O伸縮振動(dòng)

20、。</p><p>　　物理混合物的紅外光譜包含了所有的來(lái)自RSV和SBE-β-CD的特征峰，沒(méi)有表現(xiàn)出任何顯著差異。這表明，藥物仍然是完整的，藥物和環(huán)糊精之間無(wú)交互作用。相反的，與物理混合物相比，該包合物具有的相關(guān)基團(tuán)的光譜、強(qiáng)度和特征吸收峰的寬度均發(fā)生變化，顯示RSV和SBE-β-CD之間的新化學(xué)鍵的形成。</p><p>　　通過(guò)觀察高頻區(qū)域的光譜，關(guān)于“主-客”的相互作用驅(qū)使包合的

21、主要機(jī)制信息已被收集。</p><p>　　以往的研究表明，曲線擬合技術(shù)可應(yīng)用于紅外O H伸縮振動(dòng)波段，為了定量證明藥物與環(huán)糊精包合后包合物的O-H變化，O-H伸縮振動(dòng)分別是由若干未結(jié)合的RSV，SBE-β-CD組件對(duì)應(yīng)OH基團(tuán)，水分子內(nèi)或分子間氫鍵，本文做定量研究。由于O-H和C-H伸縮振動(dòng)帶部分重疊，第一塊從3700到3000cm?1，第二塊是3000～2800cm?1，所以我們最初進(jìn)行擬合的整個(gè)范圍，采用V

22、oigt處理方式，然后我們從總減去來(lái)自于甲基的對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)。最后，擬合一個(gè)僅適用于O H伸縮振動(dòng)區(qū)域更詳細(xì)的曲線。二階導(dǎo)數(shù)計(jì)算數(shù)量和波數(shù)得到RSV+SBE-β-CD1:1物理混合物和RSV/SBE-β-CD1:1的包合物，分別見(jiàn)圖6A和B，五子帶進(jìn)行區(qū)分。相應(yīng)的峰值波長(zhǎng)和百分比強(qiáng)度報(bào)告在表1中。 </p><p>　　這種光譜變化表明包合后氫鍵重排。通過(guò)看O-H在特定處理中占的百分比強(qiáng)度，我們可以假設(shè)這個(gè)

23、系統(tǒng)的包合機(jī)理。根據(jù)這一機(jī)制，客體進(jìn)入主體時(shí)會(huì)導(dǎo)致，一方面，主體腔內(nèi)的水分子部分逃脫（反映在I1下降），這將使環(huán)糊精整體重新分配。另一方面，氫鍵的改變，特別是，所觀察到I4的增加，通過(guò)對(duì)物理混合物與包合物RSV的O H基的核算，證明了包合作用建立在把RSV的分子內(nèi)氫鍵斷裂基礎(chǔ)上，且在高波數(shù)階段子峰發(fā)生遷移變化，也說(shuō)明包合過(guò)程與O-H的變化有很大相關(guān)性。、</p><p>　　在C-H伸縮振動(dòng)也檢測(cè)到明顯的變化，（

24、見(jiàn)圖5）。環(huán)糊精在2940cm?1和2889 cm?1，兩峰處，物理混合物依稀可辨，包合物完全重疊，提示在主–客體相互作用使也伴隨著C-H的參與。</p><p>　　最后，我們還觀察到在環(huán)糊精 1644 cm?1強(qiáng)烈的波段，在從物理混合物包含復(fù)雜，歸因于附著在環(huán)糊精腔的水分子彎曲振動(dòng)，這可以證明包合后一部分水分子鍵與環(huán)糊精發(fā)生斷裂，氫鍵重排，更多成為分子間氫鍵，與已被O-H伸縮振動(dòng)區(qū)的分析顯示協(xié)議。</p

25、><p>　　總之，物理混合物與包合物顯示出明顯的光譜吸收差異。</p><p><b>　　3.3體外生物測(cè)定</b></p><p>　　由于RSV顯示重要的預(yù)防癌癥活性，采用細(xì)胞活性MTT試驗(yàn)探究RSV和RSV包合物的體外癌細(xì)胞毒性。RSV水溶性差，所以為混懸劑，包合物與環(huán)糊精為溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　正如

26、預(yù)期的那樣，環(huán)糊精體外抗癌活性無(wú)顯著優(yōu)勢(shì)。</p><p>　　在試驗(yàn)時(shí)間，可以觀察到RSV與RSV包合物組MCF-7存活率明確的降低（圖7）。然而RSV包合物和游離藥物在24小時(shí)抗腫瘤活性之間無(wú)顯著差異。相對(duì)于游離藥物，RSV包合物加入 48 h和72 h后，導(dǎo)致很大程度的細(xì)胞毒性?？拱┗钚缘母纳?，可能是兩個(gè)因素：（i）SBE-β-CD對(duì)RSV增溶作用的（ii）包合物的Kc值。事實(shí)上，只有溶解的RSV（不與環(huán)糊

27、精包合的部分）能夠穿透活細(xì)胞，發(fā)揮其抗腫瘤活性。RSV的作用僅是其溶解性差的限制。另一方面，包合的RSV是完全溶解，并且對(duì)于RSV表現(xiàn)出更大的抗癌活性。然而，這個(gè)抗癌活性沒(méi)有我們?cè)趯?duì)藥物的水溶性改善的基礎(chǔ)上預(yù)期的多，或許由于包合物的KC值高，大量的藥物與環(huán)糊精穩(wěn)定結(jié)合不能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而減少影響。</p><p><b>　　結(jié)論</b></p><p>　　相溶解

28、度法、紫外可見(jiàn)光譜和紅外光譜–研究了包合物的形成</p><p>　　在溶液狀態(tài)中，以1:1形成的包合物，觀察到化學(xué)計(jì)量比和高的穩(wěn)定性常數(shù)。包合作用對(duì)溶解度有改善，且高的溶解速率。</p><p>　　隨后，F(xiàn)TIR-ATR光譜表明包合物與物理混合物存在明顯差異，特別是，通過(guò)對(duì)O-H伸縮紅外波段的分解，成功監(jiān)測(cè)包合機(jī)制。</p><p>　　初步的體外生物學(xué)的研究結(jié)

29、果表明，SBE-β-CD改善RSV對(duì)MCF-7細(xì)胞株的抗腫瘤活性。這項(xiàng)研究表明，SBE-β-CD很好的潛在價(jià)值是在RSV的口腔和/或胃腸外給藥可作為合適的輸送系統(tǒng)。事實(shí)上，高水溶性和具有快速溶出度的藥物可以提高其口服生物利用度，目前RSV的應(yīng)用也因此非常有限。此外，由于磺丁基醚-β-環(huán)糊精的生物相容性好，具有抗癌特性的液體制劑可用于非胃腸給藥。為確認(rèn)RSV–SBE-β-CD包合物非腸胃給藥的效果。其他體外和體內(nèi)研究正在進(jìn)行。</p