白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性而呈現(xiàn)抗腫瘤效應.pdf

1、背景：惡性腫瘤嚴重危害人類健康，已成為重要的致死性疾病，上世紀的發(fā)病率顯著增加。盡管現(xiàn)代醫(yī)學研究取得了巨大進步，但是大多數(shù)腫瘤仍不能被治愈?；谀[瘤的發(fā)病機制復雜而使其有效治療舉步維艱。現(xiàn)有的治療方法如化療或放療均具有明顯的毒/副作用，醫(yī)學科學工作者正研究靶向治療，使其藥物僅殺死腫瘤細胞而不傷害健康細胞。惡性腫瘤的發(fā)生受環(huán)境因素和遺傳因素共同影響，環(huán)境因素指除遺傳因素之外的所有范圍，而不僅僅指環(huán)境污染。常見的致癌環(huán)境因素包括飲食和肥胖(

2、30-35％)、吸煙(25-30％)、感染(15-20％)、輻射(10％)、精神緊張、缺乏鍛煉和環(huán)境污染物等。大多數(shù)腫瘤發(fā)生與環(huán)境因素相關(guān)，其中部分環(huán)境因素是可由生活方式控制的。因此，其實癌癥是一種有希望通過日常調(diào)理、藥物和疫苗來預防的疾病。惡性腫瘤的發(fā)生實際上是細胞分裂和生長失控，并侵入鄰近的身體部位而成癌。在眾多影響腫瘤發(fā)生的因素中，氧化應激誘導的DNA損傷及其對細胞信號轉(zhuǎn)導途徑的干擾在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用?；罴毎性S多的

3、氧化反應需要酶催化，氧化反應即分子間的氫質(zhì)子或電子轉(zhuǎn)移，這類代謝反應是生命過程所需能量的主要來源。地球上絕大多數(shù)復雜的生命體都依賴氧而生存，但是氧是一種高活性分子，生物體會分解氧氣產(chǎn)生包括過氧化氫(H2O2)、次氯酸(HOCl)和自由基如羥基自由基(·OH)、超氧陰離子（O2-）以及脂質(zhì)過氧化物等活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，這些代謝產(chǎn)物可以直接或間接地對核酸、脂類和蛋白質(zhì)造成暫時或永久性損傷，從而

4、對生物體自身造成損害。氧化-抗氧化狀態(tài)之間的不平衡造成的氧化損傷與眾多疾病的發(fā)生相關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、急性呼吸窘迫綜合癥、慢性阻塞性肺疾病和哮喘等?；谧陨肀Ｗo，機體需要多種類型的抗氧化劑以維持氧化代謝的平衡。如谷胱甘肽、維生素C、維生素E以及一些酶類，包括過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathi

5、one peroxidase，GPX)等?？寡趸缚杀Ｗo細胞免受氧化應激損傷，抗氧化酶活性和表達的失調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素。氧化應激能誘導DNA損傷并影響細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑。ROS以多種形式損傷DNA，包括堿基修飾、自由基損害（嘌呤和嘧啶）、DNA斷裂及DNA-蛋白質(zhì)交互連接等。氧化應激對腫瘤發(fā)生與治療的影響被越來越受到重視。有研究報道，前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤和其他多種腫瘤都伴有抗氧化酶

6、活性降低或其表達下調(diào);也有研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤中抗氧化酶水平無變化，或部分抗氧化酶的表達水平甚至升高。近期研究表明，多發(fā)性骨髓瘤患者血清中SOD、GPX、CAT、維生素C和維生素E水平均顯著降低;非小細胞肺癌(NSCLC)患者紅細胞裂解液中的SOD活性較低而GPX活性升高;前列腺癌患者的GPX、CAT和Cu/Zn-SOD活性均降低;口腔鱗狀細胞癌(OSCC)患者的SOD和CAT水平均降低;急性淋巴細胞白血病(ALL)患者全血中CAT和SOD

7、活性降低;膀胱癌組織中CAT和SOD活性均顯著低于正常膀胱組織;肺腫瘤組織中總SOD活性升高，CAT活性下降;肺部炎癥會產(chǎn)生高水平Mn-SOD，但CAT水平降低，二者共同作用可導致細胞內(nèi)的H2O2水平上升，因此肺炎將會為DNA損傷和細胞惡變提供有利條件，在對肺癌組織和肺癌A549細胞株的研究中發(fā)現(xiàn)SOD的水平增加、CAT水平降低、而GPX水平則無改變。惡性腫瘤是一種典型的多因素疾病，遺傳因素與環(huán)境因素對腫瘤發(fā)生的影響相互相存。DNA變異

8、可能引起原癌基因活化或抑瘤基因失活，從而使細胞分化、凋亡失控?；蛲蛔兛赡苁亲园l(fā)突變或者是暴露于輻射或致癌物質(zhì)所致?？寡趸缚煞乐笵NA的氧化損傷和延緩或改變細胞周期。某些病毒如人類T淋巴細胞病毒及某些化學物質(zhì)，特別是含苯或烷基的藥物等均是重要的致癌因素。已觀察到在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中ROS的產(chǎn)生過量和/或抗氧化途徑障礙，已發(fā)現(xiàn)在一些類型的白血病中抗氧化酶活性缺陷或表達異常。因此，保持一定水平的抗氧化酶活性對于預防惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是至關(guān)

9、重要的。另一方面，靶向抗氧化酶活性可作為腫瘤藥物治療的重要發(fā)展策略，研究發(fā)現(xiàn)，單獨采用GPX和Mn-SOD基因療法可以分別減緩腫瘤生長速率達51％和54％，GPX和Mn-SOD基因共轉(zhuǎn)染則可達到81％的腫瘤細胞生長抑制率。此外，研究抗癌藥物對抗氧化酶活性和表達水平的影響將加速藥物的作用機制研究。
　　白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一種由植物產(chǎn)生的多酚類物質(zhì)(stilbenoid)，化學名稱為3，5，4'-三羥基-反式

10、-二苯乙烯（見下圖），具有可利用的生物學活性。RSV主要存在于紅葡萄皮、豌豆、堅果、藍莓、桑椹、蔓越莓、姜黃、菠菜、百合等植物組織中，白藜蘆醇苷是RSV的前體，屬于二苯乙烯類化合物，是葡萄汁中主要的RSV前體物質(zhì);白藜蘆醇苷經(jīng)米曲霉催化可以形成RSV。事實上，白藜蘆醇苷是自然界中最豐富的RSV儲存形式。植物中RSV的合成或轉(zhuǎn)化可通過應激因素調(diào)節(jié)，如真菌污染或紫外線輻射。植物中的RSV可作為一種植物抗毒素，能抑制某些植物傳染病的發(fā)生與發(fā)展

11、。研究表明，RSV能顯著增加抗氧化酶SOD、CAT、GPX等和非酶類抗氧化物質(zhì)如還原型谷胱甘肽、維生素C、維生素E和β-胡蘿卜素等的抗氧化作用，并降低脂質(zhì)過氧化水平。RSV具有抗衰老、抗腫瘤活性，能夠延緩衰老過程并最大限度地減少與老化相關(guān)的并發(fā)癥的發(fā)生;此外，RSV還具有保護心臟、抗糖尿病、抗炎癥、抗病毒及保護神經(jīng)系統(tǒng)等多種作用。已在腫瘤細胞株、動物模型甚至臨床研究中發(fā)現(xiàn)RSV能夠抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展;并在體內(nèi)和體外研究中證實RSV對皮膚

12、癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、大腸癌、胰腺癌等具有治療或輔助治療效應。機制研究表明，RSV可通過誘導腫瘤細胞凋亡、改變細胞周期、抑制血管生成、抑制核因子-κB和環(huán)氧合酶信號轉(zhuǎn)導途徑、抑制致癌物的代謝活化、改變與腫瘤發(fā)生相關(guān)的miRNA表達模式及抗氧化等而影響腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移或凋亡（見下圖）。近期研究表明，RSV可通過干擾pAkt(l)/p70S6K信號途徑而抑制人類鼻咽癌(NPC)細胞增殖和促進其凋亡。但目前對RSV發(fā)揮作用的確切機制

13、尚未完全了解。本研究即以腫瘤細胞株為試驗模型，研究RSV經(jīng)抗氧化而抑制腫瘤細胞生長的分子機制。
　　本研究采用3種不同的腫瘤細胞株，即前列腺癌細胞株P(guān)C-3、乳腺癌細胞株MCF-7和肝癌細胞株HepG2細胞?，F(xiàn)今，這三種腫瘤都被認為是最危險的危及生命的疾病。在全球男性癌癥死亡排名六大癌癥中，前列腺癌排名第二;乳腺癌是女性最常見的浸潤性腫瘤;肝癌則是全球最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肺癌。人類前列腺癌細胞株P(guān)C-3細胞對于研究

14、中晚期前列腺癌細胞的生化變化以及評價其對化療藥物的反應性很有幫助，PC-3細胞株是雄激素非依賴性前列腺癌細胞，建株于1979年，是從一名62歲的白人男性Ⅳ級前列腺癌骨轉(zhuǎn)移樣品中分離得到的;乳腺癌細胞株MCF-7細胞是于1970年從一名69歲的白人女性患者組織樣品中分離得到的，是最常用于研究腫瘤發(fā)生機制的乳腺癌細胞;人類肝癌細胞株HepG2細胞來自于一名15歲美國白人男孩的高分化肝癌組織，HepG2細胞常用于研究肝癌的發(fā)生發(fā)展與治療機理。

15、為了比較RSV對這些腫瘤細胞的作用及其機制，本研究中我們采用人胚腎細胞株HEK293T細胞作為對照。本研究同時采用了幾株人類白血病細胞。人類早幼粒細胞白血病細胞株HL-60細胞來自于美國一位患急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的36歲女性，是研究髓樣分化的分子事件的人源細胞，APL是一種特殊類型的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)，HL-60細胞已

16、成為研究AML的良好模型;K-562細胞是建株的第一個具有無限增殖特性的人類白血病細胞系，主要用作研究慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)的發(fā)生與治療機理，K-562細胞具有特征性的基于bcr/abl融合基因的費城染色體;KT-1/A3和KT-1/A3R細胞株是本研究采用的另外兩類CML細胞，其中KT-1/A3細胞呈現(xiàn)對干擾素的抗癌效應敏感，而KT-1/A3R細胞則呈現(xiàn)干擾素抗性。研究表明，

17、RSV主要呈現(xiàn)抗氧化效應。但是，為什么在一定條件下RSV能保護正常細胞而對腫瘤細胞呈現(xiàn)細胞毒性仍然是一個有爭議的問題。此外，RSV在不同腫瘤中對抗氧化酶的表達和活性的影響效果仍然有一些不一致的結(jié)果。
　　目的：采用非腫瘤細胞株HEK293T細胞作為對照，針對RSV對部分實體瘤及白血病細胞的作用，揭示RSV對腫瘤細胞的抗氧化酶表達水平及其活性的調(diào)節(jié)作用，進而探討RSV的抗氧化活性對腫瘤細胞增殖/凋亡的影響，剖析RSV的抗氧化/抗腫瘤

18、機制。
　　方法：采用不同濃度的RSV處理前列腺癌PC-3細胞、肝癌HepG2細胞、乳腺癌MCF-7細胞、CML細胞株(K-562、KT-1/A3、KT-1/A3R)、AML細胞株HL-60細胞和非腫瘤人胚腎細胞株HEK293T細胞24-72小時，臺盼藍染色法檢測細胞生長狀態(tài)，分光光度法檢測抗氧化酶的活性和過氧化氫(H2O2)的產(chǎn)量，Western印跡定量檢測抗氧化酶的表達水平，流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡率。采用DMEM培養(yǎng)

19、基培養(yǎng)肝癌HepG2細胞和乳腺癌MCF-7細胞，采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌PC-3細胞、白血病細胞和非腫瘤HEK293T細胞，均加入10％的胎牛血清于37℃和5％濃度的CO2條件下培養(yǎng)。以1.0×105/ml細胞接種于含有1ml完全培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中，其培養(yǎng)基含有不同濃度(0、10、25、50和100μ M)的RSV;培養(yǎng)24、48和72小時后，富集細胞用于后續(xù)實驗。用臺盼藍染色法檢測細胞的生長狀態(tài)，貼壁生長細胞用胰蛋白

20、酶處理，使之與培養(yǎng)皿分離，取等體積的懸浮生長細胞培養(yǎng)物或經(jīng)胰蛋白酶處理的貼壁生長細胞懸液與臺盼藍溶液混合，顯微鏡下計數(shù)未被染成藍色的活細胞數(shù)目。以1000g、5分鐘離心富集培養(yǎng)細胞，棄上清后用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphatebuffered saline，PBS)洗滌離心細胞，然后用200μl放射免疫沉淀分析緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA)和1mM苯甲基磺酰氟(phenyl

21、methylsulfonyl fluoride，PMSF)處理細胞，冰浴30分鐘。將該溶液于12000g離心15分鐘，收集上清蛋白質(zhì)溶液，貯于-20℃?zhèn)溆?。采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，按體積比1∶1將蛋白質(zhì)溶液與考馬斯亮藍溶液混合，室溫靜置5分鐘后，以牛血清白蛋白作為蛋白質(zhì)標準溶液，于595nm處測定待測蛋白質(zhì)溶液的吸光度并計算其蛋白質(zhì)濃度。采用非連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electroph

22、oresis，PAGE)分離蛋白質(zhì)。首先，制備10％的分離膠，取dH2O7.78 ml、40％Acr:Bis4.0ml、pH8.8的1.5M Tris-HCl4.0 ml、10％ SDS160μl、10％ APS80μl和TEMED4.0μl混合均勻，倒入PAGE玻璃槽;將膠在室溫下靜置1小時后，制備4％的濃縮膠含dH2O3.3 ml、40％ Acr:Bis0.96ml、0.5M Tris-HCl(pH6.8)2.0 ml、10％ SD

23、S80μl、10％ APS40μl和TEMED4.0μl，并倒入玻璃槽中覆蓋分離膠，將梳板插入凝膠中;成膠后，用16μl蛋白質(zhì)溶液與4μl上樣緩沖液混合，95℃加熱10分鐘后上樣;同樣點上已知分子量的蛋白質(zhì)標準物，60V電泳30分鐘后，于80-85V電泳90分鐘。將凝膠上分離的蛋白質(zhì)經(jīng)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后將印跡膜于室溫浸泡在含5％脫脂牛奶的Tris緩沖生理鹽水和吐溫20(Tris-buffered saline andTween2

24、0，TBST)緩沖液中2小時。印跡膜與第一抗體孵育12小時后用TBST潤洗。然后將印跡膜與辣根過氧化物酶(HRP)第二抗體輕輕震蕩孵育2小時，然后用TBST洗滌三次?；瘜W發(fā)光反應后，在暗室暴光于X-光片，使用凝膠成像系統(tǒng)（“ImageJ”軟件）對Western印跡條帶進行高密度數(shù)字化處理，對蛋白質(zhì)條帶進行定量分析。以12000g離心5分鐘收集細胞，用PBS潤洗細胞，用含有1mMEDTA的PBS(pH7.0)勻漿，于4℃、以12000g離

25、心5分鐘后收集細胞上清液測定過氧化氫的含量和酶活性（U/mg蛋白質(zhì)）;采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性;采用鉬酸銨法測定CAT活性;利用DTNB法測定GPX活性。經(jīng)RSV誘導培養(yǎng)72小時后，12000g離心5分鐘收集細胞，用PBS(pH7.4)洗滌并于70％乙醇中固定過夜。然后用流式細胞儀（北京鼎國昌盛生物有限公司）分別分析細胞凋亡和細胞周期的百分比。對以上實驗獲取的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學軟件SPSS16.0進行單因素方差分析和比較檢驗，結(jié)果以均

26、數(shù)±標準差表示，以P≤0.05顯示其統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果:本研究結(jié)果顯示，在濃度小于50μM的RSV處理24小時后，細胞生長狀態(tài)均無明顯改變;但是，25μM RSV處理48小時顯示PC-3細胞和HepG2細胞的生長明顯受到抑制，但MCF-7細胞生長未受抑制;用10μM或者25μM的RSV處理72小時，PC-3細胞和HepG2細胞的生長明顯受到抑制，但濃度低于25μM的RSV對MCF-7細胞生長無抑制效應;50μM的RSV處理48小時或7

27、2小時對三種細胞的生長都有明顯的抑制作用，同時也抑制非腫瘤細胞株HEK293T細胞的生長;100μM的RSV對每種細胞株的生長都有明顯的抑制作用。25μM的RSV能抑制實驗中所用腫瘤細胞的生長而不影響非腫瘤細胞株HEK293T細胞的生長，本研究選擇25μM的RSV作為最佳實驗用劑量。對照組PC-3細胞中的SOD活性為4.94U/mg蛋白質(zhì)，分別用10μM、25μM和50μM的RSV處理PC-3細胞72小時，其SOD活性分別增加43％、8

28、8％和105％;對照組HepG2細胞中SOD活性為3.41U/mg蛋白質(zhì)，分別用10μ M、25μM和50μ M的RSV處理72小時，其SOD活性分別增加55％、63％和87％;對照組MCF-7細胞的SOD活性為2.82U/mg蛋白質(zhì)，用濃度為25μM和50μM的RSV處理MCF-7細胞72小時，其SOD活性分別增加54％和60％;對照組HEK293T細胞中SOD的活性為4.8 U/mg蛋白質(zhì)，低濃度的RSV（10μM或25μM）對于其

29、SOD活性沒有影響，但是50μM的RSV可使其活性增加49％。Western印跡分析顯示用濃度為25μM的RSV處理細胞72小時，PC-3、HepG2和MCF-7細胞的SOD2表達量分別增加3倍、2.5倍和1.5倍，而對HEK293T細胞的作用則不明顯;細胞的處理組和非處理組中的SOD1表達水平無明顯差異。PC-3、HepG2、MCF-7和HEK293T細胞中的CAT活性分別為4.20、4.82、4.08和7.28U/mg蛋白質(zhì)。RSV

30、處理72小時后各種細胞株的CAT活性都有一定程度的增加，25μM或50μM的RSV處理HepG2細胞后其CAT活性分別增加了45％和42％;然而RSV處理對于其他細胞的CAT活性無明顯影響;Western印跡分析顯示用RSV處理的各種細胞株的CAT蛋白質(zhì)水平均無明顯改變。HEK293T、PC-3、HepG2和MCF-7細胞中的GPX活性分別為0.65、0.60、0.74和0.60U/mg蛋白質(zhì);用10-50μM的RSV處理細胞72小時，

31、GPX活性及GPX1蛋白質(zhì)水平均無明顯變化。
　　結(jié)果：RSV能明顯提高腫瘤細胞的H2O2產(chǎn)生量。用10μM的RSV處理腫瘤細胞72小時，其H2O2水平均略微增加，而用25μM的RSV處理PC-3細胞和HepG2細胞72小時，其H2O2產(chǎn)生量均增加約2.5倍，經(jīng)同樣處理的MCF-7細胞的H2O2產(chǎn)生量略有增加。與此相反，經(jīng)10-25μM的RSV處理后，HEK293T細胞的H2O2產(chǎn)生量明顯降低。腫瘤細胞的過氧化氫產(chǎn)生量與其SOD活

32、性呈正相關(guān)。流式細胞分析表明，未經(jīng)RSV處理的PC-3細胞的凋亡率為4.40％，而經(jīng)RSV處理后，PC-3細胞的凋亡率提高了近7倍達29.11％;在未經(jīng)RSV處理的PC-3細胞培養(yǎng)液中，有50.72％的細胞處于G1期、39.71％的細胞處于S期、約9％的細胞處于G2期;而經(jīng)RSV處理后，處于G1期、S期和G2期的PC-3細胞比例分別為41.33％、58.66％和0.01％。經(jīng)RSV處理的HepG2細胞的凋亡率(22.89％)比未處理的H

33、epG2細胞的凋亡率(3.70％)提高近7倍;未經(jīng)RSV處理的HepG2細胞處于G1期、S期和G2期的細胞比例分別為53.5％、39.89％和6.61％;然而，經(jīng)RSV處理的HepG2細胞處于G1期、S期的細胞分別為50.52％和49.48％，無G2期細胞。然而，RSV對MCF-7細胞的凋亡率影響甚微;未經(jīng)RSV處理的MCF-7細胞中53.02％的細胞處于G1期、42.04％的細胞處于S期、4.94％的細胞處于G2期，而經(jīng)RSV處理的M

34、CF-7細胞處于G1期、S期的細胞分別為53.73％和46.27％，無G2期細胞。25μM的RSV處理HEK293T細胞72h小時后，細胞凋亡率和細胞周期分布均無變化(未處理組的細胞凋亡率為14.48％，處理組的細胞凋亡率為14.54％)。RSV對白血病細胞的生長抑制呈劑量依賴性，其中對HL-60細胞的生長抑制效應最明顯。用低于50μ M的RSV處理24小時后，HL-60細胞的生長狀態(tài)無明顯改變，但是25μ M的RSV處理HL-60細胞

35、48小時則明顯抑制其生長;50μM的RSV處理K-562細胞72小時可抑制其生長;100μM的RSV對于被檢測的各類白血病細胞都有明顯的生長抑制效應。RSV對白血病細胞的部分抗氧化酶表達水平及其活性具有顯著影響。Western印跡分析顯示用25μM的RSV處理HL-60細胞72小時，其SOD2表達水平升高36％，RSV處理可使K-562細胞的SOD2表達水平增加15％。然而，25μM的RSV對HL-60和K-562細胞的SOD1、CAT

36、和GPX1的表達水平均無明顯影響。未經(jīng)RSV處理的HL-60細胞的SOD活性為3.3U/mg蛋白質(zhì)，25μM的RSV處理HL-60細胞72小時則顯著增加其SOD活性至4.1U/mg蛋白質(zhì)(增加24％);25μM的RSV處理K-562細胞可使其SOD活性增加11％;RSV幾乎不改變HL-60細胞和K-562細胞的GPX活性。流式細胞分析顯示，RSV可增加白血病細胞株HL-60和K-562細胞的凋亡率，并改變其細胞周期分布。未經(jīng)RSV處理的

37、HL-60細胞的凋亡百分比為3.89％，25μ M的RSV處理72小時使HL-60細胞的凋亡百分比提高5倍(19.76％);未經(jīng)RSV處理的HL-60細胞中，有35％的細胞處于G1期、59.2％的細胞處于S期、5.7％的細胞處于G2期，而經(jīng)RSV處理的HL-60細胞處于G1期、S期和G2期的百分比分別為63.2％、36％和0.05％。RSV處理K-562細胞可使其凋亡率由4.85％升高至7.9％;未經(jīng)RSV處理的K-562細胞中，50.

38、7％的細胞處于G1期、49％的細胞處于S期、不到1％的細胞處于G2期;而RSV處理的K-562細胞中，39％的細胞處于G1期、60％的細胞處于S期、不到1％的細胞處于G期(G1/G2)期。RSV明顯影響HL-60細胞的H2O2產(chǎn)生量。用25μ M或者更高濃度的RSV處理HL-60細胞明顯增加其H2O2的生成。綜合分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞產(chǎn)生H2O2依賴于其SOD活性，并與其細胞凋亡率相關(guān)。以上研究結(jié)果表明，RSV對腫瘤細胞的生長抑制呈劑量依賴

39、性。RSV在10μM和25μM時就對PC-3和HepG2細胞生長有抑制作用，但不抑制MCF-7細胞生長;50μM的RSV能顯著抑制MCF-7細胞生長，但同時也能抑制HEK293T細胞生長。所以25μM的RSV被確定為PC-3和HepG2細胞生長抑制的最有效劑量，且此濃度不影響非腫瘤細胞株HEK293T細胞的生長。RSV能誘導腫瘤細胞尤其是PC-3和HepG2細胞凋亡。RSV抑制白血病細胞生長呈現(xiàn)劑量依賴性，且對HL-60細胞的生長抑制效

40、果強于對K-562、KT-1/A3的和KT-1A3R細胞的生長抑制效應。低濃度RSV可顯著增加PC-3、HepG2和MCF-7細胞的SOD活性;低濃度RSV幾乎不影響肝癌細胞株HepG2細胞的CAT活性及GPX活性;RSV能誘導腫瘤細胞表達SOD2，但不影響SOD1、CAT及GPX1的表達。低濃度RSV處理能使PC-3和HepG2細胞大量產(chǎn)生H2O2，高濃度RSV處理能使MCF-7和HEK293T細胞大量產(chǎn)生H2O2。細胞內(nèi)抗氧化酶的表

41、達水平和活性比例失調(diào)可能使過氧化氫產(chǎn)生量增加，繼而誘導如HepG2和PC-3等腫瘤細胞凋亡。另一方面，RSV對非腫瘤細胞如本研究采用的HEK293T細胞的抗氧化酶表達水平和活性僅呈輕微的但成比例的上調(diào)，這可能具有防止正常細胞惡變的作用;故認為RSV可能經(jīng)上調(diào)抗氧化酶表達和活性，緩解氧化應激狀態(tài)，具有預防腫瘤發(fā)生的作用。對白血病細胞的研究表明，低濃度的RSV即能抑制HL-60細胞生長，但RSV對CML細胞生長抑制、凋亡及抗氧化酶如SOD2

42、活性的調(diào)節(jié)效應不明顯;提示RSV可能通過上調(diào)SOD2表達水平和活性而使線粒體H2O2產(chǎn)生量增加，繼而誘導細胞凋亡，故此認為，RSV具有治療AML的潛能。進一步需深入研究RSV上調(diào)腫瘤細胞中抗氧化酶表達水平和活性的分子和信號轉(zhuǎn)導機制，以加速RSV的臨床應用研究進程?？寡趸副磉_水平的下降或者活性降低可能是細胞癌變的重要機制之一。因此，上調(diào)抗氧化酶表達水平或者提高其酶活性可作為預防和治療惡性腫瘤的重要策略。研究發(fā)現(xiàn)孕激素能上調(diào)過氧化氫酶表達

43、和活性，從而能夠有效預防乳腺癌;染料木素作為一種抗癌異黃酮，能夠上調(diào)前列腺癌細胞PC-3和DU145的SOD2和過氧化氫酶的表達水平;牛磺酸可經(jīng)增加SOD、GPX和CAT表達水平而有效抑制B16F10黑色素瘤細胞生長。動物實驗發(fā)現(xiàn)RSV具有抗腫瘤、抗炎癥、降血糖和保護心血管的作用，主要生物學效應是抗氧化，并能猝滅ROS，避免其對細胞的氧化損傷，其抗氧化機制類似于維生素E。所以，RSV的抗氧化活性能保護細胞免受氧化應激損傷。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄