水稻育性突變體的篩選和育性相關(guān)基因OsMSH4及PSSl的克隆與功能研究.pdf

1、水稻是世界上重要的糧食作物之一，全球一半以上的人口，包括幾乎整個東亞和東南亞的人口，都以稻米為食。在我國，水稻種植面積占全國糧食作物的1/4，并且產(chǎn)量占糧食作物的一半以上?？梢娝旧a(chǎn)的好壞直接影響我國糧食供應(yīng)和人民的生活水平。我國的人口還在持續(xù)的增長，隨著城市建設(shè)的發(fā)展，土地的荒漠化，耕地面積的逐年減少以及其它農(nóng)作物對耕地的需求所帶來的競爭，要確保水稻的供給必須提高水稻的單產(chǎn)。而育性的高低直接影響著水稻的產(chǎn)量，可是在水稻育種過程中和水

2、稻生產(chǎn)過程中，總是不可避免的會出現(xiàn)育性降低的現(xiàn)象。不同品種間組合帶來的內(nèi)部因素以及高溫，低溫，病害，等外部因素都影響水稻的育性
　　突變體是研究基因表達(dá)與功能分析的良好試驗(yàn)材料，也是當(dāng)前功能基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，本研究從育性突變體入手，首先獲得育性突變體材料，接著從細(xì)胞水平分析突變體育性降低的原因，從基因水平研究其分子機(jī)理。結(jié)果，我們從實(shí)驗(yàn)室之前得到的有一個Q6537突變體中分離到了一個新的水稻育性基因，對這個基因和實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克

3、隆的花粉半不育基因（PSS1），進(jìn)行了深入研究。這些結(jié)果豐富了人們對水稻育性的認(rèn)識和理解。
　　本論文的主要研究結(jié)果如下:
　　一.水稻育性突變體的篩選
　　從10000份T-DNA插入突變體中，最終篩選到了20個穩(wěn)定遺傳的低育性突變體和7個同時伴隨其它性狀變異的突變體，遺傳分析表明它們受單基因的控制。對其中的一個穎花突變體M3進(jìn)行了定位，結(jié)果表明與水稻extraglume1基因等位。
　　二.水稻三體不育突變體

4、Q6537的遺傳分析及OsMSH4的克隆和功能分析
　　1.本實(shí)驗(yàn)室之前獲得了一個水稻雌雄不育突變體Q6537，這個突變體來源于水稻的四倍體花藥培養(yǎng)。Q6537的自交后代可以穩(wěn)定的產(chǎn)生結(jié)實(shí)率為0％的Q6537M，結(jié)實(shí)率為29.2％的Q6537和少數(shù)其它類型，前面兩種類型的比例約為3∶1。
　　2.從34個Q6537株系共1360個單株中，得到19株正常結(jié)實(shí)的植株，14株出現(xiàn)育性的分離，分離比為3∶1（218株可育株Q6537

5、WT比65株不育株Q6537M）。
　　3.通過對Q6537的減數(shù)分裂觀察，發(fā)現(xiàn)Q6537的中期Ⅰ會出現(xiàn)12個二價體+1個單價體或11個二價體+1個三價體的染色體構(gòu)型，這表明Q6537是一個三體水稻。
　　4.利用Q6537不育突變體與秈稻9311配制組合，篩選其中的二體F1群體，用做基因的定位群體。利用分子標(biāo)記的連鎖，將定位區(qū)間縮小至60kb的范圍，通過測序發(fā)現(xiàn)區(qū)間內(nèi)OsMSH4的保守位點(diǎn)發(fā)生了一個單堿基的突變。
　

6、　5.通過對Q6537M的減數(shù)分裂觀察，發(fā)現(xiàn)大部分的同源染色體間不能正常形成二價體，導(dǎo)致同源染色體的分離出現(xiàn)紊亂，雄配子無法獲得12條整套染色體，碘-碘化鉀染色表明花粉完全不育。
　　6.水稻中的OsMSH4與擬南芥中的基因AtMSH4同源，這個基因參與同源染色體的交換，AtMSH4基因的突變使擬南芥的減數(shù)分裂時期出現(xiàn)大量單價體，育性降低。
　　7.基因的定量PCR驗(yàn)證OsMSH4是減數(shù)分裂特異表達(dá)的基因，同時，OsMSH4

7、基因的突變對其它減數(shù)分裂基因的表達(dá)量沒有明顯的影響。
　　三.水稻半不育突變體W207-2的基因PSS1的功能分析以及與其互作的基因的篩選
　　本實(shí)驗(yàn)室先前從穩(wěn)定的水稻半不育突變體W207-2中克隆了一個花粉半不育基因PSS1，PSS1編碼的是一個驅(qū)動蛋白，W207-2中PSS1的單個氨基酸的改變使蛋白的功能喪失，造成部分的減數(shù)分裂細(xì)胞出現(xiàn)少量的單價體，使花粉出現(xiàn)半不育的表型，導(dǎo)致花藥發(fā)育成熟后花粉所提供的膨壓不足，影響花藥

8、的正常開裂，從而使W207-2出現(xiàn)半不育的表型，關(guān)于這部分的詳細(xì)工作已經(jīng)發(fā)表。下面是后續(xù)的實(shí)驗(yàn)主要包括:
　　1.水稻和擬南芥的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明PSS1主要定位在細(xì)胞核中，這在空間上與減數(shù)分裂染色體和紡錘體出現(xiàn)的位置相一致。
　　2.體外的微管結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，單個氨基酸的突變使PSS1蛋白喪失了與微管結(jié)合的能力。
　　3.在pss1突變體中，沒有觀察到紡錘體出現(xiàn)明顯的缺陷，仍然以染色體出現(xiàn)單價體為主要缺陷，單價體的形成

9、可能是染色體配對異常導(dǎo)致的或者是由染色體的運(yùn)動異常導(dǎo)致的，目前的論斷更傾向于后者。
　　4.通過轉(zhuǎn)RNA干擾載體，對PSS1基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，使轉(zhuǎn)基因株中PSS1的表達(dá)量明顯的降低，結(jié)果產(chǎn)生了與W207-2一致的表型。
　　5.利用酵母雙雜交的方法，通過對水稻的穗部cDNA文庫進(jìn)行篩選得到兩個與PSS1互作的蛋白，分別是谷氨酸合酶Glutaminesynthetase(GS)和TargetingproteinforXklp