家蠶常用內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析及兩種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較.pdf

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)目前已經(jīng)成為檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平的有效方法，由于其快速靈敏及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)使得其應(yīng)用日趨廣泛。在相對(duì)定量中一般選取不同的管家基因作為內(nèi)源參照基因，用來去除不同樣本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別而校正目的基因特異性表達(dá)差異。但是近年來，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道了內(nèi)參基因的表達(dá)并不穩(wěn)定，如果沒有合適的標(biāo)準(zhǔn)化處理，目的基因的表達(dá)將會(huì)被誤導(dǎo)。
　　 本文應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了7種家蠶常用內(nèi)參基因

2、(ACT3，GAPDH,28SrRArA，RPL3，a-Tubulin，UBC和TBP)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，并利用標(biāo)準(zhǔn)化分析軟件geNorm和NormFinder進(jìn)行穩(wěn)定性分析，得出正常條件的不同組織中及不同刺激條件下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，計(jì)算出相對(duì)定量中選擇合適內(nèi)參的數(shù)目。七種常用內(nèi)參基因的選擇分別來自不同的功能，以避免出現(xiàn)表達(dá)水平的共調(diào)節(jié)。應(yīng)用雙跟蹤標(biāo)定熒光定量技術(shù)對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)水平進(jìn)行直觀的作圖，選擇目的基因GSTs1(glutathi

3、oneS-transferasesigma1)進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)GSTs1在脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平變化，比較雙跟蹤標(biāo)定定量和相對(duì)定量的結(jié)果數(shù)據(jù),進(jìn)而分析兩種方法的不同之處。最后采用GST酶活性變化水平進(jìn)一步例證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 1．候選的內(nèi)參基因的表達(dá)并不穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)化軟件分析的結(jié)果顯示，不同的實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)出合適內(nèi)參基因的種類不同，標(biāo)準(zhǔn)化程序geNorm和NormFinder給出的結(jié)果也略有不同?？紤]一致性得出結(jié)果：在正常組織中，AC

4、T3，GAPDH,a-Tubulin在中腸組織，a-Tubulin，UBC，TBP在脂肪體組織，UBC，a-Tubulin，ACT3在馬氏管組織中是最合適選擇；刺激組中，蛻皮激素處理下a-Tubulin和UBC在三種組織中：蕓香苷處理下a-Tubulin和UBC在中腸，馬氏管；ACT3和GAPDH在脂肪體中是最合適的選擇。合適內(nèi)參基因的選擇要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件，而不是武斷的參考其他物種或者一般常用的內(nèi)參照選擇。
　　 2．選用雙

5、跟蹤標(biāo)定技術(shù)能夠直觀的顯示內(nèi)參基因的表達(dá)量，通過SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，7種候選內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段的描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P值＜0.01，在不同刺激條件下刺激組與對(duì)照組之間P值＜0.05，均表現(xiàn)顯著差異性，即內(nèi)參基因的表達(dá)水平并不是穩(wěn)定不變的。
　　 3．通過檢測(cè)目的基因GSTsl的轉(zhuǎn)錄水平，雙跟蹤定量（雙外參法）與相對(duì)定量方法測(cè)得的結(jié)果略有不同。兩種方法的原理本質(zhì)存在差異之處，分析其各自特點(diǎn)，應(yīng)用雙跟蹤定量技術(shù)更為合

6、理。
　　 4．GST蛋白酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，蛋白水平與內(nèi)參基因的每轉(zhuǎn)錄水平拷貝數(shù)的相關(guān)性更高，從側(cè)面說明應(yīng)用雙跟蹤定量技術(shù)結(jié)果更為準(zhǔn)確。
　　 本研究分析指出，家蠶作為模式生物，由于其特殊的生理周期變化，相對(duì)定量技術(shù)中內(nèi)參基因的選擇不能盲目參照其他物種；公認(rèn)應(yīng)用頻率最高的內(nèi)參基因ACT3也并不是最穩(wěn)定的參照基因，在測(cè)定目的基因之前，需要對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行整體的評(píng)估。從原理和實(shí)際操作上來講，應(yīng)用雙跟蹤標(biāo)定技術(shù)能得到更加準(zhǔn)確的