犬弓首線蟲感染期幼蟲nmuc-1基因的克隆、表達及用于免疫學診斷的初步研究.pdf

1、目的：克隆并表達犬弓首線蟲感染期幼蟲nmuc-1編碼基因，初步研究nmuc-1重組蛋白的抗原性。
　　方法：制備犬弓首線蟲感染期幼蟲，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù) GenBank中登錄的T.canis幼蟲nmuc-1編碼基因的核苷酸序列（GenBank：U398015.1）和原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-1多克隆位點、利用 PCRdesign和DNaClub軟件設(shè)計擴增去信號肽的nmuc-1的引物序列，PCR擴增獲得目的基

2、因，插入原核表達質(zhì)粒 pGEX-4T-1中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta（DE3）。Western Blotting方法鑒定重組nmuc-1蛋白。用ELISA法檢測nmuc-1重組蛋白作為診斷抗原的特異性。
　　結(jié)果：成功克隆出nmuc-1基因，其序列包含完整開放閱讀框531bp，編碼176個氨基酸。推導(dǎo)出的氨基酸序列與GenBank中犬弓首線蟲 nmuc-1蛋白的同源性高，一致性達100％。編碼了一個去信號肽蛋白,為典型

3、的粘蛋白區(qū)域。PCR、雙酶切及DNA測序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒 pGEX-4T-1- nmuc-1構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果表明目的基因在大腸桿菌Rosetta（DE3）中獲得包涵體表達，經(jīng)純化得高純度蛋白。Western blot分析結(jié)果顯示重組融合蛋白為含GST標簽的目的蛋白。ELISA結(jié)果顯示nmuc-1重組蛋白能被感染犬弓首線蟲蟲卵小鼠的陽性血清和商品化的ELISA犬弓首線蟲檢測試劑盒中的抗 TES抗體識別，與感染其他種屬寄生蟲