2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、隨著人們生活方式的變化和環(huán)境污染,過敏性疾病的發(fā)病率不斷上升。過敏性疾病不僅危害人們的健康,而且給家庭和社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。螨類引起的過敏反應(yīng)是人類最常見的變態(tài)反應(yīng)。塵螨是20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的一種最強(qiáng)烈的變應(yīng)原,也是室內(nèi)變應(yīng)原中最主要的成分,多數(shù)哮喘、過敏性鼻炎及過敏性濕疹與塵螨有關(guān),嚴(yán)重影響人體健康,但目前仍沒有理想的檢測試劑及治療方法。我國在該類疾病的診治中所用的大多數(shù)是螨浸液,其中存在各種難以標(biāo)化的變應(yīng)原性和非變應(yīng)原性成分,

2、在免疫治療過程中容易產(chǎn)生各種意想不到的副作用,如在治療過程中出現(xiàn)嚴(yán)重的過敏反應(yīng),不可逆的氣道痙攣等,而且變應(yīng)原的來源不易,制備蛋白質(zhì)提取純化工藝要求較高,蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化較困難等問題。因此,螨浸液用于螨類變態(tài)反應(yīng)疾病的診治存在很多不足。研制安全高效新型變應(yīng)原疫苗具有重要意義。 研究目的 鑒于直接從粉塵螨中分離純化粉塵螨Ⅱ類、Ⅴ類主要變應(yīng)原難度較大,本研究采用基因克隆和重組表達(dá)技術(shù),獲得廣州地區(qū)粉塵螨Ⅱ類、Ⅴ類變應(yīng)原的全長基因

3、,構(gòu)建Derf2、Derf5基因原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá),以期獲得重組蛋白的高效表達(dá),為進(jìn)一步開發(fā)國產(chǎn)塵螨變應(yīng)性疾病診斷試劑盒打下基礎(chǔ),為螨類變態(tài)反應(yīng)疾病的免疫治療提供高純度、易于標(biāo)準(zhǔn)化的重組變應(yīng)原蛋白。研究方法提取廣州地區(qū)粉塵螨總RNA,并根據(jù)已知的粉塵螨Ⅱ類、Ⅴ類變應(yīng)原基因完整序列設(shè)計特異性引物,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板PCR擴(kuò)增兩條基因,并進(jìn)行TA.克隆獲得粉塵螨Ⅱ類、Ⅴ類變應(yīng)原基因。 將粉塵螨Ⅱ類、Ⅴ類變應(yīng)原基

4、因分別定向克隆至原核表達(dá)載體P<'GEX-4T-1>、P<'ET-30a(+)>,構(gòu)建P<'GEX>-Derf2、P<'ET>-Derf5原核表達(dá)質(zhì)粒;轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western-bloting分析鑒定。 純化粉塵螨Ⅴ類變應(yīng)原蛋白,免疫大鼠,5周后獲得多克隆抗體血清;利用ELISA分別檢測大鼠血清、病人血清及正常人血清,了解該蛋白的診斷價值及免疫學(xué)功能;并對粉塵螨Ⅴ

5、類變應(yīng)原進(jìn)行組織化學(xué)定位。 研究結(jié)果 1.構(gòu)建Derf2、Derf5基因克隆菌株并進(jìn)行序列測定構(gòu)建的T-Derf2/JM109、T-Derf5/JM109克隆菌株,經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定、測序結(jié)果分析表明,克隆獲得廣州地區(qū)粉塵螨Derf2、Derf5全長基因。兩者分別與GenBank中日本來源的Derf2、Derf5基因同源性為99﹪,推導(dǎo)氨基酸序列同源性也為99﹪。 2.構(gòu)建表達(dá)載體并實現(xiàn)了目的蛋白的體外表達(dá)構(gòu)

6、建的p<'GEX>-Derf2、p<'ET>-Derf5表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得可表達(dá)目的蛋白質(zhì)的大腸桿菌工程菌株p<'GEX>-Derf2/BL21、P<'ET>-Derf5/BL21,經(jīng)SDS-PAGE分析顯示目的條帶大小,與理論值相符;經(jīng)Western-bloting分析目的蛋白可分別被抗GST抗體、抗HIS抗體識別。 3.重組蛋白的純化和動物免疫重組蛋白P<'ET>-Derf5/BL21經(jīng)HIS標(biāo)簽結(jié)合柱純化,鑒定為目的蛋白

7、,ELISA分析目的蛋白免疫診斷價值;分別被豚鼠抗粉塵螨血清,人抗塵螨血清識別,正常人群有一定的假陽性率;利用獲得純化蛋白免疫大鼠,5周后ELISA檢測血清成強(qiáng)陽性,效價達(dá)1:24,000。 4.粉塵螨Ⅴ類變應(yīng)原組織化學(xué)定位組織定位結(jié)果表明粉塵螨Ⅴ類變應(yīng)原主要是消化道內(nèi)容物。 結(jié)論 1.獲取廣州地區(qū)粉塵螨Ⅱ類、Ⅴ類變應(yīng)原全長基因,并成功構(gòu)建克隆菌株T-Derf2/JM109、T-Derf5/JM109,并對序列

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