抗白葉枯病菌放線菌的篩選、鑒定和生物防治作用的初步研究.pdf

1、水稻白葉枯病是水稻主要病害之一，由水稻黃單胞桿菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo)引起的。該病害可對水稻生產(chǎn)造成重大影響，嚴(yán)重時可能顆粒無收。現(xiàn)階段的主要防治途徑是進(jìn)行化學(xué)防治，過量施加殺枯凈、噻枯唑等藥劑會導(dǎo)致病原菌抗性增強和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重破壞。
　　 放線菌類尤其是鏈霉菌類普遍應(yīng)用于抗生素生產(chǎn)，菌體廣泛存在于土壤中。研究結(jié)果顯示，鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)屬于次級代謝產(chǎn)物，可以于自然環(huán)境中發(fā)生降

2、解。其產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)，可以特異地作用于某些病原菌，降低其生長和繁殖速度，進(jìn)而可以降低病害發(fā)作的程度。這類抗生素類物質(zhì)，可以被作為生物農(nóng)藥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，在病害的生物防治中發(fā)揮著重要作用。因此，從自然環(huán)境中篩選一種對白葉枯病菌具有拮抗作用的放線菌菌株，是白葉枯病防治的一個重要方向。
　　 1:從浙江省金華市郊區(qū)水稻試驗田的土壤中篩選獲得一株抗白葉枯病菌的放線菌ACT-2菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)、16S rDNA序列分析以及進(jìn)化樹建樹分析

3、，鑒定為白蟻鏈霉菌（Streptomyces termitum）。生理生化試驗結(jié)果顯示，ACT-2可以適應(yīng)絕大多數(shù)碳源、氮源，可以降解淀粉、尿素和酪蛋白等大分子物質(zhì);對環(huán)境因素耐受能力測定顯示，其對高溫、pH和高鹽度等極端環(huán)境有一定的耐受能力。ACT-2菌株的菌體以及發(fā)酵液均對白葉枯病菌表現(xiàn)出明顯的拮抗作用，抑菌圈直徑分別達(dá)到38.00 mm和21.73 mm。經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)果顯示:ACT-2菌株在培養(yǎng)溫度28℃、初始pH7.5、搖

4、床轉(zhuǎn)速180 r/min、裝液量50/250 ml時，發(fā)酵液的抑菌效果達(dá)到最大，抑菌直徑達(dá)到26.20 mm。
　　 2:選取多種植物病原真菌和病原細(xì)菌作為供測菌，測定白蟻鏈霉菌（Streptomyces termitum）ACT-2菌株的抗菌譜。測定結(jié)果顯示:ACT-2菌株發(fā)酵液對病原細(xì)菌具有較強的拮抗能力，可以形成直徑大于20.00 mm的抑菌圈;對植物病原真菌抑制效果并不特別顯著。以水稻白葉枯病菌(Xanthomonas

5、oryzae pv.oryzae)生理小種P6菌株為指示菌，測定了ACT-2菌株發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性，發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性試驗顯示:當(dāng)溫度低于80℃、光照強度為4000 lx或經(jīng)紫外光(40 w)處理后，ACT-2菌株發(fā)酵液均可保持穩(wěn)定的抑菌能力;當(dāng)溫度高于90℃時，抑菌作用開始降低;發(fā)酵液對酸堿度較敏感，經(jīng)酸堿環(huán)境處理后，發(fā)酵液的抑菌作用出現(xiàn)了明顯降低;隨著酸堿度的增加，發(fā)酵液的抑菌能力出現(xiàn)下降。
　　 3:防效試驗，測定了白蟻鏈

6、霉菌（Streptomyces termitum）ACT-2菌株發(fā)酵液對水稻白葉枯病的防效。通過人工剪葉侵染處理4種感病水稻葉片，并以方法①（先用發(fā)酵液處理，后侵染處理）和方法②（先侵染處理，后用發(fā)酵液處理）等兩種不同方法分別處理。試驗結(jié)果顯示:病斑抑制比例最大為70.97％，病情指數(shù)最大下降了43.04％，防治效果最高可達(dá)80.80％。試驗結(jié)果顯示，方法①較之方法②的防治效果更佳理想一些，方法①更側(cè)重于預(yù)防。這說明，在對水稻白葉枯病防

7、治中，預(yù)防手段比之治療手段，效果更理想。
　　 4:按萃取劑極性，分別設(shè)定石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇作為萃取劑。通過分步萃取的方法，選擇有效的萃取劑，經(jīng)抑菌驗證，確定抑菌成分在乙酸乙酯相;將萃取物通過200-300目硅膠柱層析，梯度洗脫，抑菌作用測定，確定二氯甲烷為洗脫劑，得到含有抑菌成分的洗脫相;通過LH-20凝膠柱層析，以甲醇洗脫，得到純的抑菌成分，25℃靜置48 h獲取結(jié)晶。結(jié)晶呈黃色或者淡橙色，形狀不規(guī)則，難溶于

8、石油醚，微溶于二氯甲烷和氯仿，易溶于丙酮、甲醇和二甲基亞砜。結(jié)晶具有輕微抗生素氣味，無刺激性味道。由氫譜和質(zhì)譜的結(jié)果，分析可知:1H NMR(400.13 MHz,d6-DMSO)∶7.72(t,J=8.0 Hz,1H),7.63(d,J=1.8,1H),7.45(d,J=8.0 Hz,1H),7.32(d,J=8.0,1H),7.04(d,J=1.8 Hz,1H),2.69(s，3H)。ESI-MS∶253.1（[M-1]-）。經(jīng)比對