鴨黃病毒BZ株的生物學(xué)特性及在鴨體內(nèi)的組織學(xué)定位研究.pdf

1、自2010年4月以來(lái)，在我國(guó)大部分養(yǎng)鴨地區(qū)陸續(xù)發(fā)生了一種以感染種鴨和雛鴨為主的疫病，該病以蛋種鴨采食量和產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降、后期出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和雛鴨出現(xiàn)震顫、翻個(gè)等神經(jīng)癥狀為主要危害特征。通過(guò)臨床癥狀、病理剖檢，病原分離和鑒定、外源病毒檢測(cè)和分子序列測(cè)定等證實(shí)，該病原是一種新的鴨病毒即鴨黃病毒(DuckFlavivirus，DFV)。對(duì)鴨黃病毒感染尚無(wú)特異性療法，由于缺乏有效預(yù)防，造成該病傳播迅速、波及面廣，幾乎席卷包括浙江、江蘇、安徽、山東等

2、中國(guó)東部養(yǎng)鴨密集地區(qū)，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 1.鴨黃病毒BZ株的分離鑒定及生物學(xué)特性分析
　　 從產(chǎn)蛋下降的櫻桃谷種鴨分離出1株病毒，命名為BZ株。按常規(guī)方法對(duì)分離毒進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明：病毒與H5和H9禽流感病毒(AIV)，鴨瘟病毒(DEV)，新城疫病毒(NDV)等單因子血清無(wú)交叉反應(yīng)。參考Bagazavirus和Japaneseencephalitisvirse等黃病毒屬代表株基因組的非結(jié)構(gòu)蛋白NS

3、1基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到大小約為1061bp的目的條帶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：病毒與以色列火雞腦膜腦炎病毒(Israelturkeymeningo-encephalitisvirus，TEMV)和在馬來(lái)西亞發(fā)現(xiàn)的Tembumu病毒至少在2段基因上具有較高的同源性，屬于黃病毒屬生物學(xué)特性研究表明：該病毒為有囊膜的單股RNA病毒，對(duì)氯仿、酸和去氧膽酸鈉敏感，不耐熱，MgCL2不起保護(hù)作用。病毒無(wú)血凝性，不能凝集雞、鴨、鵝和鴿的

4、紅細(xì)胞，可適應(yīng)雞胚和鴨胚，并可在鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)上增殖并產(chǎn)生典型細(xì)胞病變，但不能在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上增殖。經(jīng)卵黃囊途徑接種的SPF雞胚以絨毛尿囊膜的含毒量最高，其次為尿囊液，胚體的含毒量最低。
　　 2.鴨黃病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　 根據(jù)鴨黃病毒的NS1基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和TaqMan探針，建立了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)病毒的方法。該方法具有特異性，對(duì)鴨病毒性肝炎病

5、毒、禽流感病毒、新城疫病毒、腺病毒、鴨瘟病毒、豬乙腦病毒等無(wú)反應(yīng)。根據(jù)目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒拷貝數(shù)與定量反應(yīng)Ct值的關(guān)系，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=-3.39X+43.18，r=0.973)。敏感性試驗(yàn)顯示建立的此方法最低可檢出1.9個(gè)TCID50病毒核酸。該方法對(duì)5只健康雛鴨人工感染86小時(shí)后的組織器官樣品(盲腸扁桃體除外)的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，與病毒
　　 分離的符合率為100％，再次證實(shí)了方法的可靠性，而且從核酸提取到出結(jié)果不超過(guò)3h

6、，是一種快速、敏感、特異的定量檢測(cè)方法。
　　 3.不同途徑人工感染雛鴨體內(nèi)鴨黃病毒的比較研究及組織學(xué)定位
　　 將200只2日齡雛鴨隨機(jī)分組：設(shè)腦內(nèi)、頸部皮下和口鼻眼三種接種組，設(shè)相關(guān)對(duì)照，分別用105.9TCID50/0.1mL的DFV攻毒。利用已建立的熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)病毒在雛鴨體內(nèi)各組織的動(dòng)態(tài)分布。結(jié)果顯示：DFV經(jīng)不同途徑感染雛鴨后，病毒在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布有一定的差異：接種6h時(shí)，腦內(nèi)接種組可在腦，脾、

7、盲腸扁桃體中檢測(cè)到病毒RNA，頸部皮下接種組可在脾中檢測(cè)到，滴鼻點(diǎn)眼口服組可在脾、氣管、盲腸扁桃體、法氏囊中檢測(cè)到；接種初期受檢組織的病毒RNA含量，腦內(nèi)接種組最高，滴鼻點(diǎn)眼口服組最低。同種接種途徑在不同的組織器官的分布不同，腦內(nèi)接種組，24h時(shí)各受檢組織均可檢測(cè)到DFVRNA，60h時(shí)含量達(dá)到最高，其中心的含量最高，氣管的含量最低，84h時(shí)各組織病毒含量相對(duì)較低；其他兩組的動(dòng)態(tài)曲線分布一致，但相對(duì)滯后。上述3種不同的感染途徑，受檢組織