不同病毒基因排列順序?qū)NA介導(dǎo)的多病毒抗性的影響.pdf

1、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是煙草生產(chǎn)中危害嚴(yán)重的三種病毒，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，培育抗病型品種勢(shì)在必行。RNA介導(dǎo)的病毒抗性是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種有效防治植物病毒病害的策略，具有抗性持久、抗病程度高、生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)，為植物抗病毒策略提供了新的途徑。本實(shí)驗(yàn)以馬鈴

2、薯Y病毒(PVY)、煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)的衣殼蛋白(coat protein，CP)基因、馬鈴薯Y病毒(PVY)的抑制子基因(HC-pro)、煙草花葉病毒(TMV)的抑制子基因(p126)和黃瓜花葉病毒(CMV)的抑制子基因(2b)為靶序列，構(gòu)建了不同病毒基因排列順序的嵌合基因發(fā)夾RNA（hairpin RNA，hpRNA）結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，通過(guò)電激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，采用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草NC89。對(duì)獲

3、得的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行抗性鑒定，比較不同病毒基因排列順序的嵌合基因?qū)NA介導(dǎo)的病毒抗性的影響，為培育多抗病毒的轉(zhuǎn)基因植株提供依據(jù)。研究獲得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)根據(jù)已克隆出的CMV CP基因和2b基因、PVY CP基因和HC-pro基因、TMV CP基因和p126基因的全序列，設(shè)計(jì)并合成引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為300bp的cDNA的片段，按不同排列順序拼接成嵌合基因，進(jìn)而分別反向重復(fù)插入雙元載體pROKⅡ中，構(gòu)建不

4、同病毒基因排列順序的嵌合基因發(fā)夾RNA(hairpin RNA，hpRNA)結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、 pTCP-HC。
　　(2)將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC通過(guò)電激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，采用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草NC89。經(jīng)過(guò)卡那霉素的篩選和PCR的鑒定，最終獲得轉(zhuǎn)

5、基因pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC的T0代植株102株、103株、116株、114株、105株、108株。
　　(3)轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交結(jié)果表明外源目的基因已成功地整合到了煙草基因組中。
　　(4)轉(zhuǎn)基因植株的Northern雜交結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因在RNA水平上都得到了表達(dá)，接毒感病的轉(zhuǎn)基因煙草中總RNA的積累量明顯高于接毒抗病的轉(zhuǎn)基因煙草，也就是說(shuō)