hpRNA的莖環(huán)比例對RNA介導(dǎo)的病毒抗性產(chǎn)生的影響.pdf

1、RNA介導(dǎo)的病毒抗性是RNAi在植物抗病毒侵染中的一種表現(xiàn)形式,侵入植物細(xì)胞的病毒基因組與轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有部分同源性,因此在PTGS所導(dǎo)致的RNA降解過程中,RNA降解系統(tǒng)識別侵入細(xì)胞內(nèi)的病毒基因組并將其與轉(zhuǎn)基因RNA一起降解。 新的研究證明發(fā)生于不同物種上的RNA沉默的直接引發(fā)因子都是雙鏈RNA(double strded RNA,dsRNA),在不同生物中dsRNA有多種形成方式。對于轉(zhuǎn)基因(正義和反義)來說,dsRNA最

2、有效的形成途徑是體外構(gòu)建具有反向重復(fù)結(jié)構(gòu)(Inverted Repeat,IR)的cDNA引入轉(zhuǎn)基因植株,這種IR結(jié)構(gòu)在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)夾RNA(hairpin RNA,hpRNA)。hpRNA中的dsRNA部分決定了反應(yīng)的特異性,是誘發(fā)基因沉默的關(guān)鍵部位。它的長度和來源均影響所誘導(dǎo)的RNA沉默的效率。hpRNA間隔區(qū)段的長度可影響轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄后hpRNA的形成和穩(wěn)定性,進(jìn)而影響基因沉默的效率。一般認(rèn)為短的間隔序列有利于hpRNA的形成,

3、保持其高度穩(wěn)定性,獲得較高的沉默效率；但研究中也發(fā)現(xiàn)間隔序列過短往往影響IR序列在細(xì)菌內(nèi)的穩(wěn)定性,影響具反向重復(fù)結(jié)構(gòu)基因的克隆。適宜的莖環(huán)比例,可能是獲得高基因克隆效率和高基因沉默效率的關(guān)鍵。 本研究選用了PVYNCP基因3'端sob序列作為hpRNA的莖,以克隆載體pUC19不同長度的序列為環(huán),構(gòu)建了具有不同莖環(huán)比例的hpRNA結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化煙草,研究了莖環(huán)比例對RNA介導(dǎo)的病毒抗性產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果將為高效hpR

4、NA的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。具體結(jié)果如下： 1.分別克隆PVYNCP 3'端704-754之間50bp的片斷作為hpRNA結(jié)構(gòu)的莖,以pUC19序列上的部分片段為hpRNA的環(huán),構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體pROK-4:1、pROK-2:1、pROK-1:1、pROK-1:2、pROK-1:4和pROK-1:8。 2.將所構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體pROK-4:1、pROK-2:1、pROK-1:1、pROK-1:2、pROK-1:4和pR

5、OK-1:8及空pROKⅡ利用凍融法直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。菌液PCR及酶切鑒定證明質(zhì)粒均已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株。 3.葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89。用卡那霉素對再生植株再次抗性篩選、PCR檢測,共獲得轉(zhuǎn)pROK Ⅱ的煙草40株。轉(zhuǎn)pROK-4:1的煙草143株,轉(zhuǎn)pROK-2:1的煙草152株,轉(zhuǎn)pROK-1:1煙草130株,轉(zhuǎn)pROK-1：2的煙草135株；轉(zhuǎn)pROK-:4的煙草132株；轉(zhuǎn)pROK-1:8的煙草126株。

6、 4.轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析,以PVYN的病汁液為接種物,汁液摩擦接種轉(zhuǎn)基因煙草。癥狀觀察及ELISA檢測表明不同的轉(zhuǎn)基因植株對PVYN的抗性存在差異。從抗病性測試結(jié)果來看,在143株轉(zhuǎn)pROK-4:1的T0代煙草中,有84株表現(xiàn)高度抗病,抗性植株比例為57.34％；152株轉(zhuǎn)pROK-2:1的T0代煙草中,有94株表現(xiàn)高度抗病,抗性植株比例為61.84％；130株轉(zhuǎn)pROK-1:1的T0代煙草中,有78株表現(xiàn)高度抗病,抗性植株比例

7、為60.00％：135株轉(zhuǎn)pROK-1:2的T0代煙草中,有69株表現(xiàn)高度抗病,抗性植株比例為51.11％；132株轉(zhuǎn)pROK-1:4的T0代煙草中有72株表現(xiàn)高度抗病,抗性植株比例為44.69％：126株轉(zhuǎn)pROK-1:8的T0代煙草中有12株表現(xiàn)高度抗病,抗性植株比例為9.52％。從發(fā)病的情況可以看出轉(zhuǎn)基因植株中抗性植株的比例與莖環(huán)比例呈一定相關(guān)性。 5.分別選取抗病性表現(xiàn)不同(抗病和感病)的部分轉(zhuǎn)基因植株提取總DNA進(jìn)行S