多小RNA組合介導(dǎo)的對PVYO與PVYN抗性比較研究.pdf

1、馬鈴薯Y病毒脈壞死株系（PVYN）和馬鈴薯 Y病毒普通株系（PVYO）是馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的兩個(gè)主要株系，侵染煙草后分別會引發(fā)系統(tǒng)脈壞死和系統(tǒng)性斑駁的癥狀。amiRNA（ artificial microRNA， amiRNA）和 siRNA（small interfering RNA，siRNA）是兩種類型的沉默介導(dǎo)因子。這兩類小 RNA（sRNA），近年來被廣泛應(yīng)用于植物抗病毒研究。本研究以 PVY

2、O的復(fù)制酶基因 NIb的兩個(gè)區(qū)域作為靶序列，分別設(shè)計(jì) siRNA和 amiRNA，構(gòu)建4個(gè)含有單 sRNA的植物表達(dá)載體和4個(gè)含有雙 sRNA的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，進(jìn)行抗病性鑒定，比較研究了多 sRNA的組合對病毒抗性的影響。研究結(jié)果為利用 RNA沉默策略高效培育抗病毒轉(zhuǎn)基因植物提供了依據(jù)。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下：
　?。?）以 PVYO復(fù)制酶基因 NIb的兩個(gè)區(qū)域作為靶序列，按照相關(guān)準(zhǔn)則分別設(shè)計(jì)siRNA和 amiRNA，

3、構(gòu)建8個(gè)植物表達(dá)載體: pR-siR1， pR-siR2， pR-miR1， pR-miR2，pR-siR1siR2，pR-miR1miR2，pR-siR1miR2和pR-miR1siR2。
　?。?）以熒光素酶（luciferase，LUC）作為報(bào)告基因與靶基因連接，構(gòu)建融合基因的表達(dá)載體PVYN-NIb-LUC和PVYO-NIb-LUC。將PVYN-NIb-LUC和PVYO-NIb-LUC分別與sRNA表達(dá)載體瞬時(shí)共侵染本生煙

4、，結(jié)果顯示，sRNA表達(dá)載體對PVYO-NIb-LUC的剪切效率均高達(dá)90％以上,尤其是同時(shí)表達(dá) siRNA和 amiRNA的表達(dá)載體，剪切效率最高可達(dá)94.3%；sRNA表達(dá)載體對PVYN-NIb-LUC的剪切效率為29%-41.5%，但共表達(dá)siRNA和amiRNA仍具有相對較高的剪切效率。
　?。?）將構(gòu)建的8種sRNA表達(dá)載體，利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，葉盤法轉(zhuǎn)化煙草 NC89，獲得轉(zhuǎn)基因植株，利用卡那霉素抗性篩

5、選和 PCR檢測，獲得各轉(zhuǎn)基因的植株150株以上。
　　（4）轉(zhuǎn)基因植株的Northern blot分析和熒光定量PCR檢測表明，各轉(zhuǎn)基因株系中均有 sRNA積累，但是積累量存在差異：含雙 sRNA的轉(zhuǎn)基因株系 pR-miR1miR2、pR-miR1siR2、pR-siR1siR2、pR-siR1miR2，sRNA表達(dá)量累加后高于含單 sRNA的轉(zhuǎn)基因株系pR-miR1、pR-miR2、pR-siR1、pR-siR2，其中pR-s

6、iR1miR2、 pR-miR1siR2株系的sRNA積累量最高。
　　（5）用含有 PVYN和 PVYO的病毒汁液接種轉(zhuǎn)基因煙草各株系，進(jìn)行抗病性分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明， pR-miR1miR2、pR-miR1siR2、pR-siR1siR2、pR-siR1miR2、pR-miR1、pR-miR2、pR-siR1、pR-siR2對 PVYN的抗病率分別為29.33%、34.54%、24.54%、46.95%、18.80%、21.35

7、%、4.04%、8.57%；對 PVYO的抗病率分別為52.34%、59.88%、47.25%、69.04%、43.20%、47.12%、42.82%、44.48%。上述結(jié)果表明，8種 sRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株均對 PVYO表現(xiàn)出較高的抗性，尤其是共表達(dá)siRNA和 amiRNA的轉(zhuǎn)基因植株，抗病率最高可達(dá)近70%；推測是由于堿基錯(cuò)配造成轉(zhuǎn)基因植株對 PVYN的抗性相對較低，但共表達(dá) siRNA和 amiRNA的轉(zhuǎn)基因植株仍可介導(dǎo)相

8、對較高的抗性水平，表明這樣的組合方式能有效減少錯(cuò)配造成的病毒逃逸。
　?。?）抗病和感病轉(zhuǎn)基因植株 Northern blot分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因在 RNA水平上得以表達(dá)，并且抗病植株中 mRNA的積累量明顯低于同類型的感病植株；抗病轉(zhuǎn)基因植株中sRNA的積累高于感病植株；表明病毒抗性是由RNA介導(dǎo)的，抗性與sRNA積累量成正相關(guān)。
　?。?）轉(zhuǎn)基因植株 Southern blot分析結(jié)果顯示，外源基因已經(jīng)成功整合到煙草的基