殼聚糖材料作為支架用于中國(guó)對(duì)蝦淋巴組織細(xì)胞的體外培養(yǎng).pdf

1、蝦病的大范圍爆發(fā)使得對(duì)蝦組織和細(xì)胞體外培養(yǎng)方面的研究引起廣泛的關(guān)注。對(duì)蝦組織和細(xì)胞的體外培養(yǎng)能獲得細(xì)胞單層，但至今沒(méi)能成功建立對(duì)蝦細(xì)胞系。需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題包括培養(yǎng)體系的優(yōu)化和獲得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。對(duì)蝦的外殼是制備殼聚糖的原料之一，所以從某種程度上說(shuō)，殼聚糖和對(duì)蝦細(xì)胞具有同源性。將殼聚糖材料用于對(duì)蝦細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性的工作，意義深遠(yuǎn)。
　　 采用物理交聯(lián)法成功制備了殼聚糖(CS)分子量不同的殼聚糖/α,β-甘油磷酸鈉(CS/α,β-

2、GP)溫敏水凝膠。流變學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CS/α,β-GP水溶液的成膠溫度隨CS的分子量增大略有增加。不同CS/α,β-GP水溶液的成膠溫度分別為：CS1/α,β-GP，25.2℃；CS2/α,β-GP，25.9℃；CS3/α,β-GP，26.2℃；S4/α,β-GP，27℃；CS5/α,β-GP，27.5℃。頻率掃描實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，不同溫度下，儲(chǔ)能模量G’和耗能模量G”隨頻率的變化情況有所不同。溫度低于成膠溫度時(shí)，體系以溶膠形式存在；溫

3、度接近或者等于成膠溫度時(shí)，溶膠開(kāi)始向凝膠轉(zhuǎn)變，但是凝膠機(jī)械強(qiáng)度較差；溫度大于成膠溫度時(shí)，形成機(jī)械強(qiáng)度較好的凝膠。這一結(jié)果與試管倒置法檢驗(yàn)溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。SEM結(jié)果表明，溫敏水凝膠的內(nèi)部是疏松的、由不規(guī)則大孔構(gòu)成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表面是一層結(jié)構(gòu)致密完整的水化膜。Na和P元素象征著α,β-GP的存在，雙蒸水平衡以后，水凝膠中Na和P的元素降低到極低的水平，說(shuō)明成膠過(guò)程中CS和α,β-GP之間沒(méi)有形成新的化學(xué)鍵生成。
　

4、　 采用傳統(tǒng)的組織塊法成功得到了原代培養(yǎng)的中國(guó)對(duì)蝦淋巴細(xì)胞。培養(yǎng)7 d能得到細(xì)胞單層，細(xì)胞逐漸由圓形變成紡錘形。培養(yǎng)25d以后，仍然可以觀(guān)察到活細(xì)胞，細(xì)胞間存在較多粘連的基質(zhì)。將中國(guó)對(duì)蝦淋巴組織接種在CS/α,β-GP溫敏水凝膠以后，熒光顯微鏡下觀(guān)察，細(xì)胞呈圓形，培養(yǎng)7 d，細(xì)胞幾乎布滿(mǎn)凝膠表面。通過(guò)測(cè)定原代淋巴細(xì)胞中過(guò)氧化物酶(POD)和堿性磷酸酶(ALP)活性及細(xì)胞相對(duì)活力的整體水平，我們可以知道，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，水凝膠能模擬

5、胞外基質(zhì)環(huán)境，降低對(duì)蝦淋巴細(xì)胞所受到的氧化刺激作用，并且能促進(jìn)對(duì)蝦淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。綜合比較殼聚糖的分子量對(duì)淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，CS3/α,β-GP具有最好的培養(yǎng)效果。
　　 傳統(tǒng)的傳代方法是胰蛋白酶消化法，但是研究結(jié)果表明，對(duì)蝦細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶具有高度敏感性，胰蛋白酶處理后細(xì)胞會(huì)受到損傷。本文采用物理方法將溫敏水凝膠破碎，使凝膠表面的細(xì)胞相互分離進(jìn)而傳代。臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞檢測(cè)法結(jié)果顯示，這種處理方法能夠保持細(xì)胞活性，并且細(xì)胞粘連

6、較少。連續(xù)傳代以后，對(duì)傳代細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，從熒光照片可以看出，傳至第四代，仍能觀(guān)察到活細(xì)胞，但是細(xì)胞數(shù)目顯著減少。這一現(xiàn)象既與細(xì)胞本身有關(guān)，體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要突破M2期的限制；還可能是由于傳代過(guò)程中有細(xì)胞損失造成。采用殼聚糖酶水解溫敏水凝膠，能夠克服傳代過(guò)程中的細(xì)胞損失，但是要控制酶作用的時(shí)間。當(dāng)酶在HBSS中作用4 h時(shí)，既能使細(xì)胞分離，又能保持較好的細(xì)胞活性。分散的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)12 h后開(kāi)始增殖。
　　 采用乳化交聯(lián)法成功

7、制備了殼聚糖微球(CMs)，微球的結(jié)構(gòu)致密、完整，呈規(guī)則的球形，輪廓清晰，均一性好。將CMs與原代的淋巴細(xì)胞共混培養(yǎng)一定時(shí)間后，微球的輪廓變得模糊，細(xì)胞能遷移到細(xì)胞表面并生長(zhǎng)，說(shuō)明將微球用于細(xì)胞培養(yǎng)是可行的。
　　 對(duì)α,β-GP、CS/α,β-GP溫敏水凝膠和CMs進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，α,β-GP對(duì)胎鼠成纖維細(xì)胞(MEF)有毒害作用。水凝膠和微球的毒性通過(guò)浸提液的細(xì)胞毒性間接反應(yīng)。對(duì)于CS/α,β-GP溫敏