轉(zhuǎn)脂肪酸去飽和酶基因PtFAD2和PtFAD3銀腺楊84K的抗寒性研究.pdf

1、不飽和脂肪酸在增加生物膜的流動性中發(fā)揮重要作用，其在生物膜中的含量與機體對低溫逆境的抗性有極強的相關(guān)性。植物不飽和脂肪酸合成是依靠脂肪酸去飽和酶完成的，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的油酸去飽和酶 FAD2 和亞油酸去飽和酶FAD3是植物產(chǎn)生多聚不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶。 油酸去飽和酶FAD2的重要功能就是向油酸(C 18：1)引入第二個雙鍵，提供質(zhì)膜結(jié)構(gòu)所需的亞油酸(C18：2) 多元不飽和脂肪酸：亞油酸去飽和酶FAD3的重要功能就是提供質(zhì)膜結(jié)構(gòu)所

2、需的亞麻酸(C18：3)多元不飽和脂肪酸。研究結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)知識，利用現(xiàn)有的楊樹基因組EST序列庫資源，通過同源序列搜索，經(jīng)過多次拼接合并獲得了理論的楊樹油酸去飽和酶基因和亞油酸去飽和酶基因cDNA序列，利用RT-PCR成功擴增了毛白楊(Populus tomentosa)PtFAD2和PtFAD3基因全長編碼序列cDNA(GenBank注冊號：DQ316788和DQ354393)；PtFAD2基因cDNA全長1276bp，

3、開放閱讀框編碼388個氨基酸；PtFAD3基因cDNA全長1199bp，開放閱讀框編碼383個氨基酸。 在克隆得到 PtFAD2 基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了植物超量表達載體pBin438-PtFAD2和植物RNAi表達載體pBI121-PtFAD2-RNAi；在克隆到PtFAD3基因的基礎(chǔ)上構(gòu)建了植物超量表達載體pBI121-PtFAD3 和RNAi表達載體pBI121-PtFAD3-RNAi。并用改進凍融法將各表達載體分別導(dǎo)入根癌農(nóng)

4、桿菌GV3101。 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法對84 K楊進行了遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)卡那霉素多步篩選得到抗性轉(zhuǎn)化植株，經(jīng)過分子檢驗證明含有目的基因的T-DNA已經(jīng)整合進84 K楊基因組。目的基因的轉(zhuǎn)錄表達相對含量經(jīng)real-time PCR 試驗分析，轉(zhuǎn)PtFAD2 超量表達的轉(zhuǎn)基因系F2-100、F2-35 與野生型植株相比，PtFAD2基因轉(zhuǎn)錄量提高了109％和74％；而轉(zhuǎn)PtFAD2 RNAi的2R-11、 2R-31轉(zhuǎn)基因系PtFA

5、D2基因轉(zhuǎn)錄量只有野生型的36％和54％。轉(zhuǎn)．PtFAD3超量表達的F3-17、F3-62轉(zhuǎn)基因系與野生型相比，PtFAD3基因轉(zhuǎn)錄量提高了60％倍和150％倍； RNAi轉(zhuǎn)PtFAD3的3R-14、 3R-20轉(zhuǎn)基因系與野生型相比，PtFAD3基因轉(zhuǎn)錄量是野生型的40％和46％?；虮磉_量分析表明，超量表達轉(zhuǎn)基因提高了相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄量，而RNAi轉(zhuǎn)基因則降低了基因的轉(zhuǎn)錄量。 提取轉(zhuǎn)基因植株葉片脂肪酸，氣相色譜分析了各組分比例，

6、結(jié)果顯示超量表達的轉(zhuǎn)基因植株葉片中不飽和脂肪酸含量有一定程度的提高，RNAi抑制表達轉(zhuǎn)基因植株中不飽和脂肪酸含量得到了降低。F2-35和F2-100轉(zhuǎn)基因系與野生型對照均值相比，亞油酸(C 18：2)含量提高5.7％和7.1％；亞麻酸(C 18：3)含量提高3.2％和2.1％；2R-11和2R-31號轉(zhuǎn)基因系與野生型對照相比，葉片中的亞油酸(C 18：2)含量降低19.3％和14.7％，亞麻酸(C 18：3)含量降低了5.3％和6.1％

7、，而油酸(C 18：1)含量提高了9.5％和8.5％。F3-17和F3-62的轉(zhuǎn)基因系亞麻酸(C 18：3)含量提高7.6％和8.7％：3R-14和3R-20號的轉(zhuǎn)基因系與野生型均值相比，葉片中的亞麻酸(C18：3)含量降低了5.9％和7.1％；亞油酸(C 18：2)含量升高了2.2％和3.2％：油酸(C 18：1)含量提高了2.8％和3.6％。在植株高度70cm左右生長期時，將生長環(huán)境溫度由25℃迅速降至4℃，低溫處理24 h后，F(xiàn)2

8、-35和F2-100轉(zhuǎn)基因系未受害率為100％和80％，F(xiàn)3-17和F3-62轉(zhuǎn)基因系植株未受害率為71.4％和75％，野生型對照未受害率為25％，而RNAi抑制的轉(zhuǎn)基因系2R-11、2R-31、3R-14、3R-20植株低溫均全部受害。結(jié)果初步表明超量表達轉(zhuǎn)基因系未受害率高于野生型植株，而RNAi轉(zhuǎn)基因系未受害率比野生型植株低。 春季扦插小苗生長到具有3-5片葉的萌芽期，將其從25℃的生長溫度環(huán)境移至-4℃低溫冷凍3 h。冷凍

9、處理后植株存活情況經(jīng)統(tǒng)計分析，結(jié)果表明野生型植株與F2-35、F2-100、F3-17和 F3-62轉(zhuǎn)基因系之間的存活率存在顯著差異，其中轉(zhuǎn)PtFAD3基因的超量表達轉(zhuǎn)基因系F3-62和F3-17存活率最高，存活率為73.3±5.7％和70±5.7％；轉(zhuǎn)PtFAD2基因的超量表達轉(zhuǎn)基因系F2-100和F2-35存活率其次，存活率為60±5.7％和56.6±3.3％；野生型存活率為37.6±3.3％。轉(zhuǎn)RNAi干擾的轉(zhuǎn)基因系3R-14、2

10、R-31、2R-11和3R-20同野生型植株存活率之間也呈顯著差異，平均存活率依次為10±10％， 10+10％， 20+0％和10±10％。同時比較了超量表達轉(zhuǎn)基因系和野生型植株的電解質(zhì)滲出率，發(fā)現(xiàn)電解質(zhì)滲出率差異同實際抗寒存活率差異相符。 通過調(diào)控脂肪酸去飽和酶基因的表達水平，一定程度上改變了楊樹脂肪酸組成，從而改變了楊樹的抗寒性。試驗證明不飽和脂肪酸在生物抗寒過程中起重要作用，尤其是亞麻酸含量同植株抗寒性直接相關(guān)，通過提高