雄激素刺激母鹿生茸區(qū)骨膜發(fā)育前后的差異蛋白篩選與分析.pdf

1、鹿茸是雄性鹿科動(dòng)物的第二性征，是唯一可以完全再生的哺乳動(dòng)物附屬器官。鹿茸發(fā)生是指雄性仔鹿進(jìn)入青春期后角柄和初角茸的形成過(guò)程。鹿額外脊上的生茸區(qū)骨膜(AntlerogenicPeriosteum，AP)是鹿茸發(fā)生的組織基礎(chǔ)。AP包含了鹿茸器官發(fā)育的藍(lán)圖。雄激素在鹿茸發(fā)生中起到重要作用，AP只有受到雄激素刺激以后才能發(fā)育形成角柄和初角茸。
　　Li.C等研究發(fā)現(xiàn)仔公鹿去勢(shì)則導(dǎo)致鹿茸發(fā)生失敗，如果注射外源性雄激素則會(huì)使去勢(shì)仔鹿的AP重新

2、發(fā)育形成角柄進(jìn)而成為鹿茸;同時(shí)雌鹿也有AP發(fā)育為角柄的潛力，但雌鹿因沒(méi)有足夠的雄性激素刺激而無(wú)法表達(dá)這一性狀。雄激素是刺激鹿茸發(fā)生的先決條件，AP發(fā)育生長(zhǎng)為鹿茸這一過(guò)程具有雄激素濃度的依賴(lài)性。AP發(fā)育形成鹿茸角柄是由體內(nèi)雄激素水平的增加引起的，AP發(fā)育與睪酮濃度的變化密切相關(guān)。為探索鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程中有無(wú)雄激素刺激AP蛋白表達(dá)的差異，利用2D DIGE技術(shù)篩選生茸區(qū)骨膜發(fā)育前后的差異蛋白。深入研究鹿茸生茸區(qū)骨膜發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)，將為揭示鹿茸發(fā)

3、生的分子機(jī)制提供基本根據(jù)。
　　1.雄激素誘導(dǎo)雌性梅花鹿生茸區(qū)骨膜發(fā)育
　　選取兩頭健康一歲齡幼母鹿，試驗(yàn)組雌鹿注射外源性雄激素（十一酸睪酮），對(duì)照組注射用于溶解雄激素的茶樹(shù)油，二者皆為每隔一周注射，持續(xù)一個(gè)月后，利用角柄發(fā)生檢測(cè)器檢測(cè)鹿茸角柄是否發(fā)育，采集生茸區(qū)骨膜進(jìn)行HE染色。結(jié)果顯示試驗(yàn)組雌鹿鹿茸生茸區(qū)骨膜發(fā)育，發(fā)育的AP細(xì)胞層明顯增厚。對(duì)照組生茸區(qū)骨膜未見(jiàn)發(fā)育，梅花鹿母鹿同公鹿一樣具有生發(fā)角柄和鹿茸的組織學(xué)基礎(chǔ)，雄激

4、素是調(diào)控鹿茸生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，人工誘導(dǎo)母鹿生茸區(qū)骨膜發(fā)育是研究鹿茸生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制的優(yōu)良模型。
　　2.鹿茸生茸區(qū)骨膜發(fā)育前后差異表達(dá)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　提取梅花鹿母鹿生茸區(qū)骨膜發(fā)育前后樣品骨膜組織總蛋白，2D DIGE試驗(yàn)和質(zhì)譜鑒定;總結(jié)質(zhì)譜鑒定結(jié)果數(shù)據(jù)，對(duì)差異表達(dá)的組織蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過(guò)生茸區(qū)骨膜組織總蛋白的2D DIGE分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05，差異倍比≥1.5)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)318個(gè)，其中有163

5、個(gè)蛋白在發(fā)育后的生茸區(qū)骨膜蛋白中上調(diào)表達(dá)，155個(gè)蛋白在發(fā)育后的生茸區(qū)骨膜中下調(diào)表達(dá)。最終鑒定出17個(gè)可用的組織差異蛋白，按功能分類(lèi)主要有結(jié)合相關(guān)蛋白，酶調(diào)活性相關(guān)蛋白，結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)蛋白，催化活性相關(guān)蛋白，抗氧化活性相關(guān)蛋白。獲得部分差異明顯的生茸區(qū)骨膜發(fā)育前后骨膜組織蛋白組表達(dá)譜，與未發(fā)育生茸區(qū)骨膜相比，在發(fā)育后的生茸區(qū)骨膜蛋白中有10個(gè)骨膜蛋白下調(diào)表達(dá)，有7個(gè)骨膜蛋白上調(diào)表達(dá)，這些蛋白很有可能參與了生茸區(qū)骨膜的發(fā)育過(guò)程，是觸發(fā)鹿

6、茸形成的關(guān)鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)14-3-3ε、GSN、COL6A2、ERBBFI1等蛋白與鹿茸發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)。
　　3.生茸區(qū)骨膜發(fā)育相關(guān)蛋白14-3-3ε蛋白基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　梅花鹿YWHAE基因編碼區(qū)核苷酸全長(zhǎng)768 bp，編碼255個(gè)氨基酸，氨基酸水平上與牛相似性高達(dá)99.6％;氨基酸序列分析表明鹿YWHAE基因編碼的14-3-3￡蛋白相對(duì)分子量為29163.86Da，主要定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，屬于可溶性蛋白;預(yù)測(cè)鹿