牛溶酶體組織蛋白酶家族及其抑制基因的克隆、表達(dá)及遺傳效應(yīng)分析.pdf

1、本研究以?xún)砷T(mén)塔爾X黃牛、日本和牛X復(fù)州牛2個(gè)雜交品種共200個(gè)個(gè)體為試驗(yàn)動(dòng)物。利用DNA測(cè)序、序列分析和PCR—RFLP等技術(shù),結(jié)合生物信息學(xué)方法,克隆和分析牛Cathepsin家族CTSB、CTSD、CTSF、CTSH、CTSL及其抑制基因CSTB,共6個(gè)候選基因的遺傳變異,探討試驗(yàn)群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及其與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系,從而獲取相應(yīng)的分子遺傳學(xué)信息,篩選對(duì)牛經(jīng)濟(jì)性狀有重要影響的分子標(biāo)記,為牛的分子標(biāo)記輔助選擇研究提供科學(xué)依據(jù)；

2、同時(shí)為牛業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)新品種或雜交新品系培育提供早期檢測(cè)方法,以節(jié)約生產(chǎn)成本提高經(jīng)濟(jì)效益。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT—PCR)技術(shù),從試驗(yàn)牛肌肉組織中克隆并鑒定了CSTB,CTSL基因cDNA的編碼區(qū)(CDS)全長(zhǎng)。利用生物信息學(xué)分析方法,獲得CSTB、CTSL蛋白的氨基酸序列,并對(duì)其特征和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果表明牛CSTB、CTSL基因分別編碼101和334個(gè)氨基酸,CSTB蛋白包含1個(gè)CY功能結(jié)構(gòu)域

3、,CTSL蛋白包含兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,包括:第29到88個(gè)氨基酸區(qū)域的inhibitor結(jié)構(gòu)域和第114到333個(gè)氨基酸區(qū)域的(Pept)結(jié)構(gòu)域。
　　 2.利用PCR—RFLP方法檢測(cè)CTSB、CTSF、CISL基因3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性,進(jìn)行基因型分型,并分析群體遺傳結(jié)構(gòu),計(jì)算基因和基因犁頻率,進(jìn)行多態(tài)信息含量檢測(cè)和哈代溫伯格平衡檢測(cè),并建立動(dòng)物模型與各測(cè)定的經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)CTSB基因與大理石紋評(píng)分性狀均存在顯

4、著相關(guān),與嫩度性狀呈極顯著相關(guān):其中從型和AB型個(gè)體的大理石紋評(píng)分等級(jí)明顯高于BB型個(gè)體(P＜0.05)；而AB型的剪切力值顯著高于AA和BB型,故嫩度明顯遜于純和基因型。(2)CTSF基因不同基因型與實(shí)測(cè)背瞟厚性狀存在極顯著相關(guān):從型的背膘厚度明顯大于BB型個(gè)體和AB型個(gè)體(P＜0.01)。(3)CTSL不同基因型與凈肉率和嫩度性狀均存在顯著相關(guān):BB型個(gè)體的凈肉率顯著大于從型和AB型個(gè)體(P＜0.05)；BB型個(gè)體的剪切力值顯著高于

5、從型和AB型個(gè)體(P＜0.05)。
　　 3.利用DNA測(cè)序的方法檢測(cè)CTSD基因Exon5、6、8的多態(tài)性,檢測(cè)到的4個(gè)SNP,并與各測(cè)定經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明:在EXON5上的C581T位點(diǎn)的多態(tài)與凈肉率之間存在顯著相關(guān):CG型個(gè)體的凈肉率顯著大于GG型和CC型個(gè)體(P＜0.05)。
　　 4.利用DNA測(cè)序的方法檢測(cè)到CTSF、CISH、CTSL基因共計(jì)20個(gè)SNP。CTSF基因intron12的A22／G

6、；exon14的3個(gè)突變,A111G、C152T、A283G；3’下游區(qū)的A72G、C92G。CTSH基因intron1的C290G、C467T；intron11的A526G、A559G；exon12的C34T、C292T；5’上游區(qū)的598AG插入。CTSL基因intron2的A103G、C134G；exon2的C92T；intron3的C165G、A230G；intron8的C692T、A702G。利用Haploview軟件對(duì)此20

7、個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行群體連鎖不平衡和單倍型分析,結(jié)果如圖3—25:20個(gè)SNP中共發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNP位點(diǎn)緊密連鎖,其他SNP均不連鎖,7個(gè)位點(diǎn)的決定系數(shù)分別為:CTSF的C152T、A283G為0.53,CTSH的C34T和C292T為0.69,CTSL的A103G和C134G為1.0,并均與C165G呈0.3的決定系數(shù)。
　　 5.對(duì)所研究的CTSF、CTSH和CTSL3個(gè)候選基因,在肝臟,心臟,脂肪,小腸,肺,肌肉,卵巢,淋巴8個(gè)組織