玫氏新本尼登蟲（Neobenedenia melleni）組織蛋白酶L基因克隆、表達及上游調控序列研究.pdf

1、組織蛋白酶(cathepsin)是一類主要存在于溶酶體中的蛋白水解酶。寄生蟲組織蛋白酶的功能涉及到寄生蟲的營養(yǎng)攝取、生長發(fā)育、組織分化、脫包囊/包囊形成、脫鞘出膜、宿主細胞組織入侵及免疫逃逸等過程，是抗寄生蟲化學藥物及疫苗設計的重要靶分子。本研究采用RACE-PCR及反向PCR等技術方法，首次克隆了對多種海水養(yǎng)殖魚類有嚴重危害的單殖吸蟲—玫氏新本尼登蟲組織蛋白酶L(cathepsin L)基因的全長cDNA、基因組編碼序列及上游轉錄調控

2、序列，并對其氨基酸序列、基因結構及轉錄因子結合位點進行了序列分析；應用RT-PCR方法對cathepsin L在玫氏新本尼登蟲不同發(fā)育時期的mRNA表達進行了半定量分析；建立了cathepsin L的原核及真核表達系統(tǒng)，表達和純化了重組cathepsin L蛋白，并以純化的重組cathepsin L蛋白制備了高效特異性玫氏新本尼登蟲cathepsin L的抗血清。對cathepsin L DNA序列的分析揭示了玫氏新本尼登蟲cathep

3、sin L的基因結構及其上游調控序列存在的多個潛在的轉錄因子結合位點。主要研究結果如下： 1．玫氏新本尼登蟲cathepsin L cDNA序列全長1070 bp，其中5’端非翻譯區(qū)長20 bp，開放讀碼框長1008 bp，3’端非翻譯區(qū)長42 bp。推導的cathepsin L前體含有335個氨基酸，其中包括17個氨基酸的信號肽、100個氨基酸的前體肽及218個氨基酸的成熟肽。具有保守的酶活性位點氨基酸殘基(C<'25>、H<

4、'159>和N<'175>)及位于前體肽中的ERF/WNIN motif。同源性分析顯示，玫氏新本尼登蟲的cathepsin L與其它物種的cathcpsin L具有一定的同源性。 2．玫氏新本尼登蟲cathepsin L基因組編碼序列長2221 bp，由四個外顯子及三個內含子組成，外顯子的大小依次分別為427 bp、226 bp、161 bp和236 bp，內含子的大小依次分別為102 bp、312 bp和757 bp。

5、 3．對玫氏新本尼登蟲不同發(fā)育時期的cathepsin L mRNA的半定量RT-PCR檢測結果顯示，在剛排出蟲卵及未出殼的鉤毛蚴中沒有檢測到cathepsin L mRNA的表達，在自由游泳時期的鉤毛蚴、童蟲及成蟲中均檢測到其mRNA的表達，而在成蟲期的表達量較高。結果提示cathepsin L可能在玫氏新本尼登蟲的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。 4．以成熟肽編碼序列構建了原核表達載體pET-22b(+)/cathepsin

6、L并在大腸桿菌中獲得成功表達。重組蛋白以包涵體形式表達，經(jīng)變性復性處理后，利用Ni<'2+>金屬螯合層析柱和Sephadex G-25進行純化和脫鹽，獲得的重組蛋白的純度為96﹪，Western blot結果證實，所獲得的重組蛋白為帶有6組氨酸標記的重組蛋白。以純化的重組蛋白為抗原，免疫新西蘭雄兔，ELISA、Western blot結果顯示，制備的玫氏新本尼登蟲cathepsin L兔抗血清具有較高的效價和特異性。 5．以編碼

7、preprocathepsin L的cDNA序列構建了C末端帶有6組氨酸標記的真核表達載體pcDNA3.0/cathepsin L，使用脂質體介導轉染并在哺乳動物細胞293T中進行了表達，利用抗6組氨酸抗體及制備的玫氏新本尼登蟲cathepsin L兔抗血清進行間接免疫熒光檢測。 6．采用反向PCR技術克隆了玫氏新本尼登蟲cathepsin L基因5’上游855 bp的序列，分析發(fā)現(xiàn)了多個潛在的轉錄因子結合位點如OCT1、NIT