母體日糧蛋白水平對仔豬骨骼肌蛋白合成及myostatin轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響及其機(jī)制.pdf

1、肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)作為骨骼肌生長的負(fù)調(diào)控因子，自發(fā)現(xiàn)以來，對其研究主要集中在基因敲除或過表達(dá)對肌肉的影響及在體外對細(xì)胞增殖和分化的影響等方面。近來的研究表明，MSTN可以通過下調(diào)骨骼肌蛋白的合成來抑制肌肉的肥大，進(jìn)而影響肌肉生長。然而，其調(diào)節(jié)蛋白合成的信號途徑還不是很清楚。骨骼肌是營養(yǎng)程序化的敏感組織，妊娠和/或哺乳期間母體營養(yǎng)不良或蛋白限飼，均可影響肌纖維的可塑性，從而影響其表現(xiàn)型。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，母體

2、日糧蛋白水平可以改變子代骨骼肌功能基因MyHC的表達(dá)，并且這種影響有階段差異，即短期的效應(yīng)和長期的效應(yīng)。然而母體日糧蛋白水平是否影響骨骼肌的蛋白合成及MSTN的表達(dá)尚不清楚，其影響是否具有階段差異也不清楚，對于造成這種差異的分子機(jī)理更是知之甚少。本研究以梅山豬為動物模型，研究母豬妊娠期和哺乳期飼喂不同蛋白水平的日糧對子代骨骼肌蛋白合成及MSTN轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響及其機(jī)制。
　　 1.母體日糧蛋白水平對子代血清中胰島素和氨基酸水平及肌

3、纖維橫截面積的影響
　　 本實驗選用14頭初產(chǎn)的小梅山母豬，體重在36.1±1.8 kg范圍內(nèi)，隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)蛋白組和低蛋白組。在妊娠期和哺乳期飼喂等能量但飼料粗蛋白含量不同的飼料。在妊娠和哺乳期間，標(biāo)準(zhǔn)蛋白組分別飼喂粗蛋白含量為12％和14％的日糧，而低蛋白組則分別飼喂粗蛋白含量6％和7％的日糧。在分娩后24小時內(nèi)，每個處理組每窩調(diào)整為7-8只小豬進(jìn)行實驗，在仔豬出生后35天斷奶，斷奶后，兩個處理組的仔豬均給以正常蛋白水平的日糧

4、飼喂，直至8月齡出欄。分別在斷奶（35天）和育肥（8月齡）進(jìn)行樣品采集。用BCA法測定斷奶仔豬和育肥豬背最長肌的蛋白濃度，用經(jīng)典HE染色法染色，測定斷奶和育肥階段背最長肌肌纖維橫截面積，用放射免疫分析法檢測血清中的胰島素水平，用氨基酸自動分析儀檢測血清中的游離氨基酸水平。結(jié)果顯示:仔豬到35天斷奶，低蛋白組的體重、肌肉重及肌肉蛋白含量均顯著低于標(biāo)準(zhǔn)蛋白組（P＜0.05），低蛋白組斷奶階段背最長肌肌纖維的橫截面積顯著低于標(biāo)準(zhǔn)蛋白組(P＜0

5、.05)，低蛋白組斷奶階段血清中胰島素水平下降，血清中游離氨基酸水平尤其是支鏈氨基酸水平極顯著降低（P＜0.01）;而到育肥階段，無論是體重、肌肉重及肌肉蛋白含量還是血清中胰島素水平、游離氨基酸水平，兩組之間均無明顯差異;而與標(biāo)準(zhǔn)蛋白日糧組相比，低蛋白組背最長肌肌纖維的橫截面積有上升的趨勢(P=0.057)，說明母體日糧蛋白水平可能通過影響子代斷奶階段血清中胰島素及氨基酸的水平來影響背最長肌的蛋白合成。
　　 2.母體日糧蛋白水

6、平對子代背最長肌胰島素和氨基酸下游信號通路及MSTN下游信號通路的影響
　　 通過以上研究發(fā)現(xiàn)，母體日糧蛋白水平影響到血清中胰島素及氨基酸的水平，是否影響其下游信號，從而影響骨骼肌的蛋白合成？是否其它因素也參與影響骨骼肌的蛋白合成？我們運(yùn)用Western blotting方法檢測了胰島素的下游信號胰島素受體（Insulin receptor，IR）和Akt的蛋白表達(dá)，同時檢測了氨基酸下游蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵因子——p70S6K和eIF

7、4E的表達(dá)。用Real-time PCR檢測了肌肉發(fā)育相關(guān)基因(MSTN、MyoD、MEF2和Myogenin)及氨基酸下游相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母體日糧蛋白水平并沒有影響胰島素的下游信號，但母體低蛋白日糧顯著下調(diào)了子代斷奶階段氨基酸下游蛋白合成關(guān)鍵因子p70S6K和eIF4E的磷酸化水平(P＜0.05)，并顯著下調(diào)了氨基酸下游信號eIF2α的表達(dá)(P＜0.05);同時我們還發(fā)現(xiàn)母體低蛋白日糧顯著降低了斷奶仔豬氨基酸信號下游關(guān)鍵基因

8、ATF4、LAT1和CHOP的表達(dá)（P＜0.05），然而對肌肉發(fā)育相關(guān)的基因除MSTN外，并無顯著影響。MSTN是氨基酸敏感基因，并且對骨骼肌蛋白質(zhì)的合成起重要的調(diào)節(jié)作用。母體低蛋白日糧，顯著降低了子代斷奶階段背最長肌MSTN的mRNA水平(P＜0.05)，但顯著上調(diào)了育肥階段MSTN的mRNA水平(P＜0.05)。于是，我們檢測了MSTN的受體ACVR2B和ALK5的表達(dá)，并檢測了其下游信號smad2/3、p38-MAPK、ERK和J

9、NK及其磷酸化形式的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低蛋白組斷奶階段背最長肌ACVR2B的mRNA水平顯著升高(P＜0.05)，ALK5的mRNA水平有升高的趨勢（P=0.073）;smad2和p38-MAPK的磷酸化水平顯著升高;而育肥豬兩組之間沒有顯著差異，提示母體日糧蛋白水平可能通過氨基酸和MSTN信號通路影響子代斷奶階段骨骼肌蛋白的合成。
　　 3.母豬日糧蛋白水平影響子代背最長肌MSTN轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的分子機(jī)理
　　 由以上的研究，

10、我們發(fā)現(xiàn)母體日糧蛋白水平對MSTN的mRNA水平在斷奶和育肥階段的影響截然相反，為探索母體程序化作用的機(jī)制，我們運(yùn)用Western blotting方法檢測背最長肌MSTN轉(zhuǎn)錄因子（FOXOI、MyoD、CREB和C/EBPβ）在核內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果顯示，到斷奶階段，低蛋白組C/EBPβ（LAP*）在核中的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）;提示C/EBPβ可能參與MSTN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。而到育肥期C/EBPβ的蛋白表達(dá)，兩組之間均無顯著差異。為了探

11、討C/EBPβ是否參與MSTN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，采用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）方法檢測了C/EBPβ在MSTN啟動子區(qū)的結(jié)合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斷奶階段，低蛋白組C/EBPβ與MSTN啟動子區(qū)的3個預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合情況顯著降低(P＜0.05)，而育肥階段，低蛋白組C/EBPβ與3個預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)中的2個的結(jié)合情況顯著升高(P＜0.05);這與MSTN的mRNA水平變化一致，提示C/EBPβ參與MSTN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。為探索表遺傳是否參與MSTN

12、的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，運(yùn)用ChIP方法檢測了MSTN啟動子區(qū)的組蛋白修飾情況，結(jié)果顯示，育肥階段，低蛋白組組蛋白的乙?；斤@著升高(P＜0.05)，組蛋白H3第9位賴氨酸的一甲基化(H3K9me1)水平顯著降低（P＜0.05），而組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化(H3K27me3)水平顯著升高（P＜0.05），而斷奶階段兩組之間組蛋白的修飾并無顯著差異，提示組蛋白的修飾可能參與了育肥階段MSTN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Real-time PCR檢測了以M

13、STN為靶的miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)育肥階段低蛋白組miR-500和miR-136的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），miR-27a的表達(dá)有下降的趨勢(P=0.057)，而斷奶階段兩組之間miRNA的表達(dá)并無顯著變化，提示miRNA可能參與了育肥階段MSTN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。以上結(jié)果提示:妊娠和哺乳期間母體日糧蛋白水平影響MSTN的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，并且這一影響呈階段特異性。斷奶階段MSTN的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可能由C/EBPβ介導(dǎo)，而育肥階段MSTN的轉(zhuǎn)錄不僅由C