公豬膻味物質糞臭素的乳酸菌降解研究.pdf

1、公豬具有飼料轉化率高、胴體瘦肉率高、脂肪多不飽和脂肪酸含量高以及避免動物去勢等優(yōu)點。但公豬膻味是目前阻礙公豬生產的主要障礙。糞臭素(3-甲基吲哚)是引起公豬膻味的兩大主要物質之一。雖已有選育低膻味的豬種、飼養(yǎng)管理調控糞臭素水平等方面的研究,但尚處于理論研究階段。免疫去勢又會喪失公豬的部分優(yōu)良性能。因此在加工環(huán)節(jié)進行公豬膻味的控制顯得十分必要。而目前這方面的研究主要限于熏制、腌制、與普通豬肉混合使用和添加香辛料對膻味進行掩蓋,缺乏對糞臭素

2、具有針對性的處理和對加工過程中糞臭素變化的研究。因此開展了對乳酸菌降解糞臭素的探索。主要開展了以下4方面的工作,并取得一定的成果:
　　 (1)糞臭素對受試乳酸菌生長的影響及4菌株降解糞臭素能力的比較。分別在MRS培養(yǎng)基和限制碳、氮源的調整MRS(MMRS)培養(yǎng)基中測定了0、0.5、2.0和5.0μg/mL四個糞臭素濃度下短乳桿菌1.12(Lactobacillus bevis,Lac1.12)、乳酸菌1.454(Lactoba

3、cilus lactis,Lac1.454)、植物乳桿菌102(Lactobacillus plantarum,Lac102)和乳鏈球菌6020(Streptococcuslactis,Str6020)72h內的生長曲線。比較了上述3個濃度水平時4株菌在MRS和MMRS兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)192h對糞臭素的降解率。并對菌體在磷酸鹽緩沖液中吸附/吸收糞臭素的能力進行了研究。結果表明:0.5-5.0μg/mL的糞臭素能導致菌株生長總量下降,5.

4、0μg/mL時發(fā)生12h左右的遲滯,Lac1.12比其他菌株的耐受能力強。菌株對糞臭素的敏感性與糞臭素濃度和培養(yǎng)基的組成都有關。在兩種培養(yǎng)基和3個糞臭素濃度下Str6020對糞臭素的降解都顯著高于其他3菌株達到22.17-28.05％。培養(yǎng)基和糞臭素濃度對Str6020的降解率沒有顯著影響,但其余各菌在0.5μg/mL時的降解率(2.56-3.63％)顯著低于2.0和5.0μg/mL(6.41-10.35％)。磷酸鹽緩沖液中的非生長的菌

5、體可吸收/吸附0.85-2.96％的糞臭素,培養(yǎng)基中減少的糞臭素僅有小部分是由于吸收/吸附。未發(fā)現(xiàn)菌株對糞臭素的敏感性和菌株降解能力間的相關性。
　　 (2)Str6020降解糞臭素部分Ⅰ相代謝產物的分離鑒定。發(fā)酵液經乙酸乙酯萃取,N2吹揮去有機溶劑,殘留物用甲醇溶解后進行HPLC分析。HPLC分析分別采用了醋酸銨緩沖液:乙腈和磷酸鹽緩沖液:乙腈兩種流動相進行梯度洗脫。同時用二極管陣列紫外檢測器及熒光檢測器檢測。通過與對照品的保

6、留時間和紫外吸收圖譜比對進行產物定性分析。并將代謝產物對照品添加到MMRS中用Str6020培養(yǎng)以了解對照品被菌株利用的情況。現(xiàn)有HPLC條件下各目標組分分離良好。共檢測到4個分別與對照品保留時間相同的峰。其中與3-甲基羥基吲哚(3-methyl oxindole,3MOI)和3-甲基-3-羥基-吲哚-2-酮(3-hydroxy-3-methylo-xindole,HMOI)峰對應物質的紫外吸收特征也和相應對照品一致,而與鄰氨基苯乙酮(

7、2-aminoacetophenone,2AM)峰對應物質的紫外吸收和對照品不同,吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol,I3C)在陰性對照中也有檢出,只是陰性對照中含量更低。Str6020可利用添加于培養(yǎng)基中的3MOI、HMOI、13C和3-吲哚甲酸(indole-3-carboxylic acid,13CA)。初步判斷3MOI和HMOI是Str6020代謝糞臭素的產物,2AM和13C需進一步鑒定。未檢測到3-吲哚甲酸(i

8、ndole-3-carboxylic acid,13CA)。3MOI和HMOI的存在表明Str6020降解可首先發(fā)生在2位的氧化。
　　 (3)比較糞臭素發(fā)酵前后對細胞生長、DNA損傷和細胞周期的影響。用1.1-4.4μg/mL糞臭素在發(fā)酵前后分別干預人肺扁平上皮癌細胞QG-56。用MTT比色法測定細胞的生長,用堿性彗星(單細胞凝膠電泳)實驗測定細胞DNA的單鏈損傷,用流式細胞技術測定細胞周期分布。結果表明:發(fā)酵后對細胞生長的毒

9、性降低,1.1和4.4μg/mL時差異顯著?；畚查L、彗星長、尾部DNA％、Olive矩和彗星尾/頭(長)指標均顯示發(fā)酵后細胞DNA單鏈損傷降低,但差異未達顯著水平(P＜0.05)。流式細胞分析未檢測到細胞凋亡和細胞周期的顯著改變。可見發(fā)酵
　　 處理不會導致糞臭素在上述三方面毒性的增加。
　　 (4)糞臭素降解主要外界影響因素的篩選和模擬公豬肉中糞臭素的降解。在單因素試驗的基礎上通過PB實驗設計方法篩選發(fā)酵溫度、NaNO

10、2濃度、NaCl濃度、培養(yǎng)基初始pH值和接種量5個因素中對Sir6020降解糞臭素影響顯著的因素。添加糞臭素到公豬肉中使糞臭素濃度達2.0μg/mL作為模擬公豬肉,以Str6020作發(fā)酵菌株生產模擬公豬肉香腸,分析發(fā)酵后肉中糞臭素含量變化。結果表明:影響排前3位的因素分別是發(fā)酵溫度、NaNO2濃度、NaCl濃度,貢獻值分別達65.29％、15.5％和11.06％,三者累積91.90％,對糞臭素降解影響顯著。經25℃發(fā)酵144h公豬肉中的

11、糞臭素比發(fā)酵前降低了12.65％,且降解主要是Str6020作用的結果。
　　 此文進行了乳酸菌降解培養(yǎng)基和豬肉中糞臭素的研究,篩選到具有較強降解能力的Str6020菌株。首次對乳酸菌體外降解糞臭素的Ⅰ相代謝產物進行了分離鑒定。共檢測到4種代謝產物,其中兩種為HMOI和3MOI。采用單細胞凝膠電泳技術、MTT細胞生長測定技術和流式細胞技術對糞臭素經Str6020降解前后在細胞生長、DNA單鏈損傷和影響細胞周期分布三方面毒性的作用