TNP-LPS和TNP-KLH誘導(dǎo)的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)抗體分泌細(xì)胞的分化研究.pdf

1、虹鱒作為硬骨魚(yú),代表了免疫系統(tǒng)進(jìn)化史上的一個(gè)重要的階段,對(duì)其免疫系統(tǒng)的研究具有重要的意義。針對(duì)三硝基苯基.脂多糖(TNP-LPS,TL,T細(xì)胞非依賴(lài)性1型抗原),三硝基苯基.匙孔血藍(lán)蛋白(TNP-KLH,TK,T細(xì)胞依賴(lài)性抗原)以及三硝基苯基-匙孔血藍(lán)蛋白-脂多糖(TNP-KLH-LPS,TKL,嵌合抗原)免疫的虹鱒,對(duì)免疫后虹鱒的血液,脾臟和腎臟中的不同發(fā)育階段的抗原誘導(dǎo)的B細(xì)胞進(jìn)行了為期兩年的監(jiān)測(cè)。分析了ex vivo抗體分泌細(xì)胞,

2、漿細(xì)胞,in vitro抗原可誘導(dǎo)B細(xì)胞的組織分布及動(dòng)態(tài)變化。同時(shí),虹鱒是世界上廣泛養(yǎng)殖的重要冷水魚(yú),現(xiàn)在鮭鱒類(lèi)養(yǎng)殖用的疫苗主要是革蘭氏陰性細(xì)菌苗,保護(hù)性免疫通常是菌苗和佐劑一起使用。但是這種疫苗劑型會(huì)影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。若要制備更有效的對(duì)魚(yú)體無(wú)損害的疫苗,就必須明了其免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制。本文通過(guò)比較這三種抗原的在細(xì)胞水平上的免疫效果,為設(shè)計(jì)更為行之有效的水產(chǎn)疫苗奠定基礎(chǔ)。對(duì)免疫后的四組虹鱒(TL,TK,TKL,對(duì)照)在第0,6,16,25

3、,35,44周取血,每組每次取3至10條,運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)對(duì)抗體效價(jià)和抗體親和力進(jìn)行分析?？贵w效價(jià)結(jié)果表明,TL和TKL抗原的抗體反應(yīng)均在16周至25周之間出現(xiàn)峰值。TL和TKL顯示了快速而激烈的初次免疫應(yīng)答。TK抗原的初次應(yīng)答較為遲緩平穩(wěn)。TKL較TL反應(yīng)更快更高一些,顯示了嵌合抗原的優(yōu)勢(shì)。對(duì)親和力的研究顯示,這三種抗原均呈現(xiàn)出不同程度的親和力成熟。TK和TKL組與TL組相比具有較高的親和力,TKL的親和力最高,親和

4、力成熟亦最為顯著,再次表明了嵌合抗原優(yōu)于TL和TK。
　　 在免疫后的第0,6,16和44周解剖魚(yú)體,每組每次3至4條,分別取血,脾臟,前腎和后腎4種組織,收集組織中的淋巴細(xì)胞進(jìn)行ex vivo和in vitro培養(yǎng),用細(xì)胞周期抑制劑羥基脲(HU)在in vitro培養(yǎng)過(guò)程中來(lái)區(qū)分漿母細(xì)胞(HU抑制其細(xì)胞周期)和漿細(xì)胞。淋巴細(xì)胞的in vitro可誘導(dǎo)能力是由在in vitro培養(yǎng)過(guò)程中加入特定濃度的TL抗原來(lái)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞來(lái)確定

5、的。而后采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)定量組織中的抗體分泌細(xì)胞,觀察抗體分泌細(xì)胞(漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞)在各種組織中的分布情況。從ELISPOT結(jié)果來(lái)看,大量漿細(xì)胞(約85％)存在于虹鱒的前腎(相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的骨髓),而在血液,脾臟和后腎的均有較少的分布。漿母細(xì)胞和可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞(未成熟淋巴細(xì)胞和免疫記憶細(xì)胞)主要分布于外周血淋巴(72％)中,,在脾臟(14％)和前腎(16％)中的分布極少。對(duì)ex vivo的ELISPOT分析證明,

6、自發(fā)的抗體分泌細(xì)胞主要存在于前腎中(86％)。后腎中可分離出來(lái)的白細(xì)胞數(shù)量很少,所以從總體來(lái)看其所含有的漿細(xì)胞,漿母細(xì)胞和可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞都比較少。針對(duì)三種不同的抗原,漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞以及未成熟淋巴細(xì)胞和記憶細(xì)胞的組織分布情況大致相同。就其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量而言,TKL顯示出了極大的優(yōu)勢(shì),TK也同樣產(chǎn)生了很好的免疫反應(yīng)和免疫記憶。TL免疫后的白細(xì)胞,抗原誘導(dǎo)的in vitro反應(yīng),血細(xì)胞和脾細(xì)胞呈現(xiàn)出50到100倍的增加,而前腎

7、中的白細(xì)胞僅增加了10倍。TD免疫后的白細(xì)胞,in vitro培養(yǎng)抗原誘導(dǎo)后,血細(xì)胞和脾細(xì)胞呈現(xiàn)出500倍的增加,而前腎中的白細(xì)胞僅增加了30倍。
　　 第46周分別用TL和TK抗原二次免疫TL組和TK組來(lái)分析TI-1抗原和TD抗原在硬骨魚(yú)的產(chǎn)生免疫性記憶的能力。二次免疫后,分別在第16和46周取血,脾臟和前腎每組每次4尾,從抗體效價(jià),抗體親和力以及產(chǎn)生抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量來(lái)看,這兩種抗原均可使魚(yú)體產(chǎn)生免疫性記憶。這與哺乳動(dòng)物的只

8、有對(duì)TD抗原才能產(chǎn)生免疫記憶的現(xiàn)象不同,虹鱒對(duì)TI-1抗原的二次免疫應(yīng)答要比TD抗原更快更激烈。
　　 對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)收集的淋巴細(xì)胞進(jìn)行HU定時(shí)(每24hr添加1次)添加實(shí)驗(yàn),來(lái)分析B細(xì)胞在硬骨魚(yú)主要免疫組織(血液,脾臟和前腎)中的的增殖分化情況。它可以確定三種細(xì)胞的量:1)處于分裂增殖狀態(tài)的抗體分泌細(xì)胞(如漿母細(xì)胞),2)誘導(dǎo)的可以過(guò)渡到早期漿細(xì)胞的漿母細(xì)胞(由HU敏感變?yōu)镠U不敏感),3)穩(wěn)定的漿細(xì)胞(HU不敏感)。結(jié)果表明,

9、不管是在初次免疫后還是二次免疫后,血液中自細(xì)胞的in vitro反應(yīng)僅是由漿母細(xì)胞組成。而脾臟中,in vitro誘導(dǎo)的漿母細(xì)胞則可以分化為短壽漿細(xì)胞。與之相反的,免疫后16周前腎擁有一定數(shù)量的漿細(xì)胞。在前腎淋巴細(xì)胞的in vitro培養(yǎng)中添加TL抗原和HU對(duì)其幾乎沒(méi)有影響,它們?cè)谂囵B(yǎng)的初始就已經(jīng)出現(xiàn),并且一直存在于培養(yǎng)的過(guò)程中。這表明前腎中的大部分B淋巴細(xì)胞為B細(xì)胞分化的最終階段即漿細(xì)胞。
　　 運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析各時(shí)間點(diǎn)包括