石灰氮對(duì)堆肥化過(guò)程中牛源致病性大腸桿菌抑制及對(duì)堆肥化效果影響.pdf

1、試驗(yàn)通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)直接從健康奶牛直腸采集鮮糞樣、在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大腸桿菌的分離培養(yǎng)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)、生化特征試驗(yàn)、血清型分型、多重PCR技術(shù)等系統(tǒng)研究了牛源致病性大腸桿菌的分布及特征，并探討了草藥對(duì)不同血清型牛源致病性大腸桿菌的抑菌效果。同時(shí)，將石灰氮作為抑菌劑添加牛糞堆肥中，研究了其對(duì)不同血清型牛源致病性大腸桿菌的抑菌效果。項(xiàng)目研究將對(duì)大腸桿菌傳播、感染提供有力防控措施，對(duì)我國(guó)奶牛業(yè)的健康發(fā)展和防治致病菌病爆發(fā)具有重要意義。并且，石灰氮在堆肥中

2、的應(yīng)用研究對(duì)擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域提出了一條新的可行性路線。研究?jī)?nèi)容主要分三部分：
　　第一部分，牛源致病性大腸桿菌分離鑒定、毒力因子檢測(cè)以及藥物試驗(yàn)
　　試驗(yàn)從內(nèi)蒙古包頭市規(guī)?；膛?chǎng)206頭泌乳奶牛和呼倫貝爾市4個(gè)牧業(yè)旗個(gè)體戶奶牛場(chǎng)212頭泌乳奶牛直腸采集鮮糞樣，進(jìn)行了大腸桿菌分離培養(yǎng)、生化特征試驗(yàn)、血清型分型、動(dòng)物致病性試驗(yàn)和多重PCR技術(shù)檢測(cè)毒力因子。在此基礎(chǔ)上，選擇具有抗菌、低毒、耐藥性發(fā)生率低的草藥進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)，檢

3、測(cè)其防治致病性大腸桿菌能力。結(jié)果表明：⑴包頭市采集糞樣中大腸桿菌檢出率為83.50％，其中致病性大腸桿菌占40.12%。其優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O2和O8，分別占定型菌株38.89%、33.33%和14.81%。呼倫貝爾市采集糞樣中大腸桿菌檢出率為47.64%，其優(yōu)勢(shì)血清型為O149、O131、O2和O96，分別占定型菌株9.30%、8.14%、6.98%和6.98%。⑵多重PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，呼倫貝爾市采集糞樣中33.66%糞樣和2

4、7.72%菌株分別攜帶毒力因子。其中，eaeA基因檢出率最高，其攜帶率分別為糞樣的26.73%和菌株的22.11%。并且，非典型腸致病性大腸桿菌（aEPEC）分布最廣，其攜帶率為糞樣的21.78%和菌株的18.15%。⑶草藥對(duì)呼倫貝爾市試驗(yàn)菌抑菌能力為蒼術(shù)＞瓜蔞＞黃芩＞黃連＞蒲公英。對(duì)包頭市試驗(yàn)菌抑菌能力為黃芩＞黃連＞瓜蔞＞蒼術(shù)＞蒲公英。證實(shí)不同藥物體外抑菌效果存在差異，同一種藥物對(duì)不同血清型牛源致病性大腸桿菌抑菌效果也有所不同。

5、>　　第二部分。鮮牛糞堆肥中添加石灰氮對(duì)不同血清型牛源致病性大腸桿菌的抑制試驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室堆肥技術(shù)研究了不同比例石灰氮（0%、2%、3%和4%）在不同堆
　　肥溫度條件下（20℃、30℃、37℃、50℃和60℃），對(duì)鮮牛糞堆肥中不同血清型牛源致病性大腸桿菌（O2、O8、O78和O86）的抑菌效果，并探討了石灰氮對(duì)鮮牛糞堆肥中內(nèi)源性大腸桿菌、嗜溫菌和嗜熱菌的抑菌作用。同時(shí)，通過(guò)以無(wú)菌水和菌液調(diào)整滅菌牛糞水分含量（調(diào)節(jié)至45%、65%和

6、85%）后，添加不同比例石灰氮（0%、2%、3%和4%）進(jìn)行堆肥，研究了牛糞堆肥水分含量對(duì)石灰氮抑菌效果影響。另外，采用不同濃度石灰氮培養(yǎng)基（0.01–10.00 mg·mL–1）上接種不同血清型牛源致病性大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)和不同血清型牛源致病性大腸桿菌菌液中添加不同濃度石灰氮（1.00–10.00 mg·mL–1）進(jìn)行培養(yǎng)，分析了石灰氮對(duì)不同血清型牛源致病性大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖的直接影響。結(jié)果表明：⑴鮮牛糞堆肥中添加3%和4%石灰氮，對(duì) O

7、2和O8血清型牛源致病性大腸桿菌具有良好的抑菌作用。無(wú)論在高溫（50℃和60℃）還是在中低溫（20℃、30℃和37℃）條件下，均能在較短的時(shí)間內(nèi)（3d）可徹底殺滅O2和O8血清型致病性大腸桿菌。添加2%石灰氮，在高溫條件下抑菌效果好于中低溫條件。并且，石灰氮對(duì)O2和O8血清型致病性大腸桿菌的抑菌效果存在顯著差異，對(duì)內(nèi)源性大腸桿菌的抑菌效果也呈現(xiàn)類似的規(guī)律。⑵鮮牛糞堆肥中添加3%石灰氮，在30℃和50℃條件下對(duì)嗜溫菌和嗜熱菌生長(zhǎng)有一定影響

8、，但嗜溫菌和嗜熱菌基本上保持正常的生長(zhǎng)規(guī)律。⑶鮮牛糞堆肥中添加石灰氮對(duì)牛源致病性大腸桿菌的抑菌作用與堆肥水分含量有密切關(guān)系。堆肥水分含量85%時(shí)最有利發(fā)揮石灰氮抑菌作用，其次為65%，最弱為45%，表明堆肥水分含量高有利于發(fā)揮石灰氮抑菌作用。⑷石灰氮對(duì)不同血清型牛源致病性大腸桿菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。隨石灰氮濃度的增加對(duì)致病性大腸桿菌的抑菌效果也明顯增強(qiáng)。而且，石灰氮對(duì)牛源致病性大腸桿菌的抑菌效果受溫度影響，堆肥高溫（50℃和60℃）有利

9、發(fā)揮其抑菌作用。另外，石灰氮對(duì)不同血清型牛源致病性大腸桿菌生長(zhǎng)的抑菌效果存在差異。
　　第三部分，石灰氮對(duì)鮮牛糞堆肥化效果影響
　　試驗(yàn)在堆肥原料中分別接種不同血清型牛源致病性大腸桿菌（O2、O78和O86）菌液，設(shè)添加0%、2%和3%石灰氮組，進(jìn)行63d堆肥。在堆肥期內(nèi)定期測(cè)定物理、化學(xué)和生物學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明：⑴鮮牛糞堆肥中添加2%石灰氮，堆肥溫度在29–31d達(dá)到最高值40.1–45.9℃，pH值在35d達(dá)到8–9。從4

10、2d開(kāi)始，T值降至0.72以下，堆肥結(jié)束時(shí)，GI達(dá)到140.16–155.70%。添加3%石灰氮堆肥未出現(xiàn)高溫期，溫度范圍在19.6–28.7℃，pH值基本高于9。堆肥結(jié)束時(shí)，T值仍在1左右的高水平，GI達(dá)到119.87–129.55%。⑵鮮牛糞堆肥中添加2%和3%石灰氮，對(duì)堆肥中富營(yíng)養(yǎng)菌、貧營(yíng)養(yǎng)菌和放線菌的變化規(guī)律及活性未產(chǎn)生明顯影響，對(duì)蛋白質(zhì)分解菌的變化規(guī)律有一定影響。添加3%石灰氮對(duì)蛋白質(zhì)分解菌活性未產(chǎn)生明顯影響，而添加2%石灰氮

11、則降低蛋白質(zhì)分解菌活性。對(duì)油脂分解菌、淀粉分解菌和纖維素分解菌的變化規(guī)律未產(chǎn)生明顯影響，添加石灰氮可提高油脂分解菌活性，對(duì)淀粉分解菌和纖維素分解菌活性未產(chǎn)生明顯影響。⑶鮮牛糞堆肥中添加2%和3%石灰氮，可明顯縮短殺滅堆肥中大腸桿菌的時(shí)間，同時(shí)隨石灰氮添加量的增加抑菌效果也明顯提高。
　　總之，鮮牛糞堆肥中添加石灰氮，可有效殺滅堆肥中不同血清型牛源致病性大腸桿菌，同時(shí)添加2%石灰氮對(duì)堆肥化過(guò)程的順利進(jìn)行不會(huì)產(chǎn)生明顯影響。由此可見(jiàn)，通