石灰氮對堆肥化過程中牛源致病性大腸桿菌抑制及對堆肥化效果影響.pdf

1、試驗通過現(xiàn)場直接從健康奶牛直腸采集鮮糞樣、在實驗室進行大腸桿菌的分離培養(yǎng)、動物致病性試驗、生化特征試驗、血清型分型、多重PCR技術等系統(tǒng)研究了牛源致病性大腸桿菌的分布及特征，并探討了草藥對不同血清型牛源致病性大腸桿菌的抑菌效果。同時，將石灰氮作為抑菌劑添加牛糞堆肥中，研究了其對不同血清型牛源致病性大腸桿菌的抑菌效果。項目研究將對大腸桿菌傳播、感染提供有力防控措施，對我國奶牛業(yè)的健康發(fā)展和防治致病菌病爆發(fā)具有重要意義。并且，石灰氮在堆肥中

2、的應用研究對擴展其應用領域提出了一條新的可行性路線。研究內容主要分三部分：
　　第一部分，牛源致病性大腸桿菌分離鑒定、毒力因子檢測以及藥物試驗
　　試驗從內蒙古包頭市規(guī)?；膛?06頭泌乳奶牛和呼倫貝爾市4個牧業(yè)旗個體戶奶牛場212頭泌乳奶牛直腸采集鮮糞樣，進行了大腸桿菌分離培養(yǎng)、生化特征試驗、血清型分型、動物致病性試驗和多重PCR技術檢測毒力因子。在此基礎上，選擇具有抗菌、低毒、耐藥性發(fā)生率低的草藥進行了體外抑菌試驗，檢

3、測其防治致病性大腸桿菌能力。結果表明：⑴包頭市采集糞樣中大腸桿菌檢出率為83.50％，其中致病性大腸桿菌占40.12%。其優(yōu)勢血清型為O78、O2和O8，分別占定型菌株38.89%、33.33%和14.81%。呼倫貝爾市采集糞樣中大腸桿菌檢出率為47.64%，其優(yōu)勢血清型為O149、O131、O2和O96，分別占定型菌株9.30%、8.14%、6.98%和6.98%。⑵多重PCR技術檢測結果表明，呼倫貝爾市采集糞樣中33.66%糞樣和2

4、7.72%菌株分別攜帶毒力因子。其中，eaeA基因檢出率最高，其攜帶率分別為糞樣的26.73%和菌株的22.11%。并且，非典型腸致病性大腸桿菌（aEPEC）分布最廣，其攜帶率為糞樣的21.78%和菌株的18.15%。⑶草藥對呼倫貝爾市試驗菌抑菌能力為蒼術＞瓜蔞＞黃芩＞黃連＞蒲公英。對包頭市試驗菌抑菌能力為黃芩＞黃連＞瓜蔞＞蒼術＞蒲公英。證實不同藥物體外抑菌效果存在差異，同一種藥物對不同血清型牛源致病性大腸桿菌抑菌效果也有所不同。

5、>　　第二部分。鮮牛糞堆肥中添加石灰氮對不同血清型牛源致病性大腸桿菌的抑制試驗采用實驗室堆肥技術研究了不同比例石灰氮（0%、2%、3%和4%）在不同堆
　　肥溫度條件下（20℃、30℃、37℃、50℃和60℃），對鮮牛糞堆肥中不同血清型牛源致病性大腸桿菌（O2、O8、O78和O86）的抑菌效果，并探討了石灰氮對鮮牛糞堆肥中內源性大腸桿菌、嗜溫菌和嗜熱菌的抑菌作用。同時，通過以無菌水和菌液調整滅菌牛糞水分含量（調節(jié)至45%、65%和

6、85%）后，添加不同比例石灰氮（0%、2%、3%和4%）進行堆肥，研究了牛糞堆肥水分含量對石灰氮抑菌效果影響。另外，采用不同濃度石灰氮培養(yǎng)基（0.01–10.00 mg·mL–1）上接種不同血清型牛源致病性大腸桿菌進行培養(yǎng)和不同血清型牛源致病性大腸桿菌菌液中添加不同濃度石灰氮（1.00–10.00 mg·mL–1）進行培養(yǎng)，分析了石灰氮對不同血清型牛源致病性大腸桿菌生長繁殖的直接影響。結果表明：⑴鮮牛糞堆肥中添加3%和4%石灰氮，對 O

7、2和O8血清型牛源致病性大腸桿菌具有良好的抑菌作用。無論在高溫（50℃和60℃）還是在中低溫（20℃、30℃和37℃）條件下，均能在較短的時間內（3d）可徹底殺滅O2和O8血清型致病性大腸桿菌。添加2%石灰氮，在高溫條件下抑菌效果好于中低溫條件。并且，石灰氮對O2和O8血清型致病性大腸桿菌的抑菌效果存在顯著差異，對內源性大腸桿菌的抑菌效果也呈現(xiàn)類似的規(guī)律。⑵鮮牛糞堆肥中添加3%石灰氮，在30℃和50℃條件下對嗜溫菌和嗜熱菌生長有一定影響

8、，但嗜溫菌和嗜熱菌基本上保持正常的生長規(guī)律。⑶鮮牛糞堆肥中添加石灰氮對牛源致病性大腸桿菌的抑菌作用與堆肥水分含量有密切關系。堆肥水分含量85%時最有利發(fā)揮石灰氮抑菌作用，其次為65%，最弱為45%，表明堆肥水分含量高有利于發(fā)揮石灰氮抑菌作用。⑷石灰氮對不同血清型牛源致病性大腸桿菌的生長具有抑制作用。隨石灰氮濃度的增加對致病性大腸桿菌的抑菌效果也明顯增強。而且，石灰氮對牛源致病性大腸桿菌的抑菌效果受溫度影響，堆肥高溫（50℃和60℃）有利

9、發(fā)揮其抑菌作用。另外，石灰氮對不同血清型牛源致病性大腸桿菌生長的抑菌效果存在差異。
　　第三部分，石灰氮對鮮牛糞堆肥化效果影響
　　試驗在堆肥原料中分別接種不同血清型牛源致病性大腸桿菌（O2、O78和O86）菌液，設添加0%、2%和3%石灰氮組，進行63d堆肥。在堆肥期內定期測定物理、化學和生物學指標。結果表明：⑴鮮牛糞堆肥中添加2%石灰氮，堆肥溫度在29–31d達到最高值40.1–45.9℃，pH值在35d達到8–9。從4

10、2d開始，T值降至0.72以下，堆肥結束時，GI達到140.16–155.70%。添加3%石灰氮堆肥未出現(xiàn)高溫期，溫度范圍在19.6–28.7℃，pH值基本高于9。堆肥結束時，T值仍在1左右的高水平，GI達到119.87–129.55%。⑵鮮牛糞堆肥中添加2%和3%石灰氮，對堆肥中富營養(yǎng)菌、貧營養(yǎng)菌和放線菌的變化規(guī)律及活性未產生明顯影響，對蛋白質分解菌的變化規(guī)律有一定影響。添加3%石灰氮對蛋白質分解菌活性未產生明顯影響，而添加2%石灰氮

11、則降低蛋白質分解菌活性。對油脂分解菌、淀粉分解菌和纖維素分解菌的變化規(guī)律未產生明顯影響，添加石灰氮可提高油脂分解菌活性，對淀粉分解菌和纖維素分解菌活性未產生明顯影響。⑶鮮牛糞堆肥中添加2%和3%石灰氮，可明顯縮短殺滅堆肥中大腸桿菌的時間，同時隨石灰氮添加量的增加抑菌效果也明顯提高。
　　總之，鮮牛糞堆肥中添加石灰氮，可有效殺滅堆肥中不同血清型牛源致病性大腸桿菌，同時添加2%石灰氮對堆肥化過程的順利進行不會產生明顯影響。由此可見，通