鄱陽湖泥鰍黑色素相關(guān)基因及其蛋白分子特征表達分析以及胚胎發(fā)育和苗種培育研究.pdf

1、鄱陽湖泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)具有較為豐富的遺傳多樣性，體型和體色均有明顯的差異性，為本課題組的良種選育提供了極好的材料。本研究以鄱陽湖泥鰍為材料，主要開展了兩個方面的工作：一是，首次克隆獲得鄱陽湖泥鰍黑色素聚集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)和黑色素刺激激素(α-melanophore-stimulating hormone，α-MSH)及它們的受體黑色素聚

2、集激素受體1(melanin-concentrating hormone receptor1,Mchr1)和黑色素刺激激素受體1(α-melanophore-stimulating hormone receptor1,Mc1r)基因，初步探究了四個基因與鄱陽湖泥鰍黑斑性狀形成的關(guān)系；二是，研究了不同發(fā)育溫度、水體透明度和初始投喂時間對泥鰍仔魚成活率的影響，探討適宜條件以提高水花苗的健康程度和成活率。獲得的主要研究成果如下：
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3、、利用RACE-PCR分別克隆出泥鰍前原黑色素聚集激素1(prepro-melanin-concentrating hormone,Pmch1)基因、阿片黑素促皮質(zhì)激素原(proopiomelanocortin,Pomc)基因、黑色素聚集激素受體1(Mchr1)基因和黑色素刺激激素受體1(Mc1r)基因的cDNA全長序列，分別命名為MaPmch1、MaPomc、MaMchr1、MaMc1r。運用生物信息學(xué)軟件對4個基因及其蛋白質(zhì)的理化性

4、質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進行了預(yù)測分析，并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。
　?。?）MaPmch1基因cDNA全長591bp，編碼含124個氨基酸的蛋白質(zhì)。泥鰍PMCH1（MaPMCH1）C末端經(jīng)水解可產(chǎn)生17個氨基酸的環(huán)形神經(jīng)肽MCH1。MaPMCH1是親水性蛋白，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。MCH1超二級結(jié)構(gòu)具有一個反平行β-折疊片層，通過二硫鍵連接形成環(huán)形神經(jīng)肽。同源比對發(fā)現(xiàn)泥鰍MCH1（MaMCH1）氨基酸序列與其它硬骨魚類完全一致。系統(tǒng)進化樹顯示

5、泥鰍PMCH1與鯉科魚類PMCH1聚為一支。在哺乳動物、鳥類和魚類中，MCH存在高度保守的序列RCM*GRVYRPCW(*代表隨機氨基酸)。
　?。?）MaPomc基因cDNA全長為1133 bp，編碼含221個氨基酸的蛋白質(zhì)。泥鰍POMC（MaPOMC）的107-119處水解產(chǎn)生13個氨基酸的α-MSH。同源分析結(jié)果說明泥鰍α-MSH（Maα-MSH）氨基酸序列與其他物種完全一致，具有HFRW結(jié)構(gòu)，是一個重要的功能域。系統(tǒng)進化樹

6、顯示MaPOMC與鯉科魚類在同一進化方向上，且獨立于鯉科魚類之外。
　?。?）MaMchr1基因和MaMc1r基因cDNA全長分別為1364 bp和1529 bp，編碼產(chǎn)生包含328個氨基酸的泥鰍MCHR1（MaMCHR1）和316個氨基酸的泥鰍MC1R（MaMC1R）。預(yù)測兩者的二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主，三級結(jié)構(gòu)均存在7個跨膜結(jié)構(gòu)域，并具有DRY（天冬-精-酪）結(jié)構(gòu)，是典型的G蛋白偶聯(lián)受體。MaMCHR1和MaMC1R與鯉科魚類

7、都具有較高的同源性（90％左右），系統(tǒng)進化樹同樣表明兩者在進化方向上與傳統(tǒng)分類地位相吻合。
　　2、利用qPCR檢測不同花斑泥鰍背部皮膚、腹部皮膚和全腦組織的4個基因的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MaPmch1基因在不同花斑泥鰍大腦中的表達情況無明顯規(guī)律。MaPomc基因在小花斑泥鰍大腦中的表達量高于大、無花斑泥鰍，推測高表達的α-MSH能促進小花斑泥鰍在黑斑處分泌更多的黑色素，從而形成較多的黑斑。MaMchr1基因的表達主要集中在大腦，且在

8、不同花斑泥鰍腦中表達差異不顯著；MaMc1r基因的表達集中在大腦和背部皮膚，大、小花斑泥鰍腦和背部皮膚表達量相當(dāng)，無花斑泥鰍大腦中的表達量高于背部皮膚。推測MaMchr1基因參與黑色素沉著較少，而MaMc1r基因背部皮膚表達高有助于黑斑形成。無花斑泥鰍MaPmch1/MaPomc值高于大、小花斑泥鰍說明，在泥鰍體內(nèi)通過調(diào)節(jié)MaPmch1和MaPomc基因表達量的比例來實現(xiàn)泥鰍不同花斑的黑色素沉著模式。
　　3、本文詳細描述了泥鰍胚

9、胎發(fā)育的24個時期，當(dāng)水溫為24℃或27℃時，胚胎發(fā)育分別歷時31 h20 min和24 h。泥鰍胚胎發(fā)育的有效積溫為307.65時度，生物學(xué)零點溫度為14.18℃。泥鰍孵化水溫對孵化率影響不明顯，但對仔魚出膜72 h后的成活率影響較顯著，24℃和27℃的成活率分別為72.42%和65.84%。在一定溫度范圍內(nèi)，水溫越高，胚胎發(fā)育時間越短，仔魚成活率越低。當(dāng)水體的透明度為5 cm時，孵出72 h后的仔魚成活率為71.83%，顯著低于15