禽源NDV Hbnu株分離培養(yǎng)鑒定、F基因測序分析.pdf

1、目的：新城疫病毒(Neweastle disease virus， NDV)屬副粘病毒科Avulavirus屬，為單股負鏈RNA病毒，由Doyle于1927年首次分離并命名。NDV能夠在禽類中引起一種致死率極高的急性接觸性傳染病----新城疫，雞、火雞及野雞等都有易感性。NDV在極少數(shù)情況下可以感染人類，表現(xiàn)為輕微的結膜炎或溫和的呼吸道癥狀，目前沒有發(fā)現(xiàn)人到人的水平感染，但近些年來新城疫病毒更多的是以其抗腫瘤作用強、對人安全性高等特點吸

2、引著越來越多的關注。NDV能感染多種人類腫瘤細胞且不依賴于腫瘤細胞增殖而獨立復制繁殖，腫瘤細胞不能發(fā)揮有效的抗病毒作用是因為干擾素信號轉換途徑的損傷，從而使NDV在細胞中生長復制，進一步殺傷腫瘤細胞。本實驗的研究對象為未知序列的新城疫病毒HBnu株，目的在于通過分子生物學、細胞學及信息技術方面的方法對其F基因序列進行比對分析，也出于對實驗室安全的考慮，分析F基因112～117位點，可以確定其型別及致病性、抗腫瘤細胞選擇性等。
　　

3、 方法：選取本校分離自圈養(yǎng)禽類的HBnu株（2008年分離），接種雞胚以擴增病毒，48h后收取雞胚尿囊液，測定血凝效價≥1:1280后，其血凝性均可被NDV的陽性血清所抑制而不被禽流感(H9和H5)單因子陽性血清及EDS-76陽性血清抑制。采用紅細胞吸附釋放法純化病毒，使其血凝效價≥1:1280，常規(guī)復蘇人傳代食道癌細胞ECA109細胞進行細胞學實驗，復蘇后選擇生長狀態(tài)良好，密度較大的進行NDV HBnu株感染試驗，觀察其抗腫瘤效果，

4、選擇最好溶瘤效果的病毒液進行分子生物學研究，用RNA試劑盒提取病毒RNA后，逆轉錄合成cDNA。根據GenBank上所公布的新城疫病毒的全基因組序列和相關參考文獻，采用Primer5.0系統(tǒng)設計3對引物，引物設計采取使擴增片段之間部分相互重疊的原則，使片段連接起來可以覆蓋整個病毒基因組，特異性片段的PCR產物純化并測序，從而獲得F基因組序列，并通過生物信息學軟件對其與其他NDV國際毒株進行了比較分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，確定NDV HB

5、nu株的分子生物學特征及進化關系，其關鍵序列為：112G-K-Q-G-R-L117，符合國際標準弱毒株規(guī)律，判定NDV HBnu株為弱毒株。
　　 結果：NDV HBnu株第一次經過SPF雞胚擴增后測定的血凝效價，第二次經過紅細胞吸附釋放法后測定的血凝效價后測定的血凝效價均≥1:1280，得出NDV HBnu株的HA蛋白功能完整，具有凝血活力，初步驗證該病毒株具有正常的病毒毒力。
　　 通過對ECA109細胞感染后的凋亡

6、實驗，再次證明NDV HBnu株具有細胞殺傷作用，而且病毒毒力正常。
　　 NDV HBnu株F基因序列均由1707個堿基組成，屬于基因Ⅱ型，與GenBank公布的clone30株和LaSota弱毒株的F基因序列長度相近，通過序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)clone30株和LaSota弱毒株的同源性較高，屬于進化樹同一分支。NDV HBnu株的F基因關鍵位點112～117為GlyLys-Gln-Gly- Arg-Leu符合國際標準弱毒株規(guī)

7、律，判定NDV HBnu株為弱毒株。
　　 結論：
　　 1.NDV HBnu株是一株具有殺傷腫瘤細胞且具有正常病毒毒力的毒株，抗腫瘤細胞的選擇性主要在消化道上皮癌細胞最為突出，符合弱毒株的特性。
　　 2.NDV HBnu株F基因組序列由1707個堿基組成，屬于基因Ⅱ型弱毒力病毒株。
　　 3.NDV株與其他GenBank上公布的24株毒株比較，核苷酸同源性在73％-95.5％之間，氨基酸同源性在50.