山東省NDV分離鑒定與F、HN基因序列分析及肢體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種主要侵害雞、火雞、野禽等禽類的高度接觸性、致死性傳染病，多呈敗血經(jīng)過(guò)，主要特征表現(xiàn)為下痢、呼吸困難、漿膜及黏膜出血，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一。雖然目前我國(guó)采取了多種防治措施來(lái)控制ND的大規(guī)模流行，但是隨著NDV新基因（亞）型的出現(xiàn)、宿主范圍擴(kuò)大和毒力增強(qiáng)等因素，使得ND的防控更加復(fù)雜化。因此，加強(qiáng)NDV分子流行病學(xué)的監(jiān)控，研究代表性流行毒株的致病

2、性對(duì)明確NDV毒株的流行趨勢(shì)具有重要意義。本研究包括三部分:
　　1.新城疫流行毒株F和HN基因克隆和序列分析
　　從山東省等地養(yǎng)禽場(chǎng)疑似ND的病料中分離鑒定出11株NDV，對(duì)其F和HN基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆序列測(cè)定分析。結(jié)果表明，所有NDV分離株F基因長(zhǎng)度為1662nt，編碼553個(gè)氨基酸，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為95.4％～99.8％和89.7％～99.8％; HN基因長(zhǎng)度為1716nt，編碼571個(gè)氨基酸，核苷酸和氨基

3、酸序列同源性分別為96.7％～99.9％及96.3％～99.7％。其F蛋白前體F0裂解位點(diǎn)附近的氨基酸序列均為112RRQKRF117，符合NDV強(qiáng)毒株的特征。將11株NDV分離株與GenBank中31株參考毒株F基因核苷酸序列繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。分析發(fā)現(xiàn)幾株分離株均屬于基因Ⅶd亞型，表明基因Ⅶ型NDV是目前山東省的優(yōu)勢(shì)基因型。
　　2.新城疫不同宿主毒株致病性研究
　　為闡明不同基因亞型或不同宿主來(lái)源NDV對(duì)禽類的致病性差

4、異，本文研究設(shè)計(jì)了兩個(gè)動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)。第一個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選取兩株鴨源基因Ⅶ型NDV，以0.2和0.5 mL劑量分別通過(guò)滴鼻或肌肉注射對(duì)商品鴨進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，同時(shí)用0.1 mL劑量通過(guò)滴鼻感染SPF雞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPF雞攻毒后于3天～6天100％發(fā)病死亡，而實(shí)驗(yàn)鴨未見(jiàn)明顯發(fā)病死亡但有排毒。第二個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選取了一株ND鴿源基因Ⅵ型和一株基因Ⅶ型流行毒株對(duì)鴿子進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示基因Ⅵ型毒株對(duì)鴿有高度致病性，鴿感染后表現(xiàn)癱瘓、翅膀下垂或斜頸等

5、神經(jīng)癥狀和排綠色稀糞，而對(duì)SPF雞無(wú)明顯的臨床癥狀不表現(xiàn)致病性;Ⅶ型流行毒株對(duì)鴿子致病性不強(qiáng)有排毒表現(xiàn)。不同禽源分離株的致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，各種禽源NDV對(duì)不同宿主致病性存在差異。
　　3.膠體金免疫層析試紙條的研制
　　采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，用純化的單抗C3B3標(biāo)記，制備金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜;將純化的單抗1E1固定于硝酸纖維素膜(NC)上作為捕獲抗體組裝成NDV免疫膠體金檢測(cè)試紙條。使用此試紙條可以特異性地檢ND