殼聚糖抑制蜂花粉源菌群效果的熒光定量PCR檢測.pdf

1、本文主要用常規(guī)PCR技術(shù)鑒定了蜂花粉源的致病菌種類,用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了水溶性殼聚糖溶液抑菌前后蜂花粉源菌群的變化,同時還對油菜蜂花粉源的菌株特別是蜜蜂球囊菌的水溶性殼聚糖抑菌濃度進行了研究。結(jié)果如下:
　　 (1)從油菜蜂花粉中分離得到真菌9株(F1-F9),細菌12株(B1-B12)。通過形態(tài)學(xué)鑒定,初步判定F1、F5為土曲霉菌株；F4為黑曲霉菌株；F2、F3、F6和F7為根霉菌株；F8為擬蜜蜂球囊菌菌株；F9為擬

2、黃曲霉菌菌株；B1-B12大多數(shù)為擬芽孢桿菌菌株。
　　 (2)根據(jù)形態(tài)學(xué)初步鑒定的結(jié)果,本試驗選擇出6個菌種(芽孢桿菌、黃曲霉、土曲霉、根霉、黑曲霉和蜜蜂球囊菌),分別設(shè)計引物,進行常規(guī)PCR技術(shù)鑒定。所得PCR產(chǎn)物測序后經(jīng)與NCBI比對表明:F1、F5為土曲霉；F4為黑曲霉；F2、F3、F6和F7為根霉；F8為蜜蜂球囊菌；F9為黃曲霉菌；B1-B12菌株中除B6和B8外,其他均為芽孢桿菌。
　　 (3)采用常規(guī)PCR

3、技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù),分別檢測不同濃度水溶性殼聚糖對蜂花粉源6種菌群的抑制情況。結(jié)果表明:以混合菌株提取的DNA為模板進行的常規(guī)PCR,其各自產(chǎn)物的電泳條帶亮度并不能給出其各自受到抑制前后的DNA總量的變化。由熒光定量PCR技術(shù)得到的CT值表明:水溶性殼聚糖對6種菌均有一定的抑制作用；隨著濃度增加,其抑制作用增強。
　　 (4)以不同濃度梯度的水溶性殼聚糖溶液,對蜂花粉源的真菌(菌株F1-F9)、細菌(菌株B1-B12)

4、進行抑制試驗。結(jié)果顯示:水溶性殼聚糖溶液對真菌的抑制效果較好。真菌中各個菌株對殼聚糖的耐力有所不同,由弱到強依次為(以抑制率達到50％以上時的殼聚糖濃度排序):F7和F8(大于0.02g／mL時),F1和F3(大于0.04g／mL時),F4(大于0.06g／mL時)；F2、F6和F9有一定耐力,F5有較強耐力。細菌中各個菌株對殼聚糖的敏感性大不相同,由強到弱分別為(以殼聚糖的最小抑菌濃度MIC排序):B4(0.003125g／mL),B

5、2、B3、B5、B6、B10、B11和B12(0.00625g／mL),B8(0.0125g／mL),Bl、B7和B9(0.025g／mL)。
　　 (5)選取對殼聚糖耐力最弱的蜜蜂球囊菌(蜜蜂白堊病的主要致病菌)進行進一步的抑制試驗,結(jié)果顯示:培養(yǎng)48h后,濃度為0.04g／mL以上的平板內(nèi)不長菌落,其抑制率為100％,濃度為0.04g／mL以下的菌落比對照組生長緩慢。培養(yǎng)72h后,濃度為0.08g／mL以上的平板內(nèi)不長菌落,