楊扇舟蛾等幾種重要林業(yè)昆蟲細胞系的建立及顆粒體病毒體外增殖研究.pdf

1、迄今為止，國內(nèi)外已經(jīng)建立了來源于150多種昆蟲的800株以上的昆蟲細胞系，其中260株以上為鱗翅目昆蟲的細胞系，但相對于已知的幾十萬種昆蟲來說，這些細胞系還遠遠不夠。在某些研究方面，仍然需要特定昆蟲種類來源或者特定細胞類型的細胞系。在培養(yǎng)細胞中，各種病毒也具有不同的受納細胞系統(tǒng)。一般說來，核型多角體病毒比較容易在昆蟲細胞系中復(fù)制，但在顆粒體病毒中至今尚未建立一個比較滿意的顆粒體病毒—細胞離體系統(tǒng)，因此，有必要建立更多新的昆蟲細胞系，為害

2、蟲病毒的規(guī)?；瘮U增打下基礎(chǔ)。本研究選取9種重要的林業(yè)害蟲進行細胞系建立和桿狀病毒增殖，并嘗試對已建立的細胞系進行無血清培養(yǎng)，試圖為林業(yè)昆蟲病毒殺蟲劑的規(guī)?；a(chǎn)以及桿狀病毒表達載體系統(tǒng)的構(gòu)建和研究，提供有效的技術(shù)手段。
　　本研究選取的9種重要的林業(yè)害蟲為：楊扇舟蛾（Clostera anachoreta）、美國白蛾（Hyphantria cunea）、春尺蠖（Apocheima cinerarius）、棗尺蠖（Sucra juj

3、uba）、茶尺蠖（Ecotropis Obliqua）、光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）、桑天牛（Apriona germari）、鞭角華扁葉蜂（Chinolyda flagellicornis）、月季葉蜂（Arge pagana）。對這些害蟲先進行解剖，取胚胎、卵巢、精巢、血細胞和脂肪體，然后建立原代培養(yǎng)，選用TNM-FH, IPL－41, Excell－405, Excell－420, TC-100昆蟲

4、培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。結(jié)果表明，產(chǎn)下約4天的鱗翅目昆蟲受精卵比較容易游離出細胞并建立成細胞系。
　　經(jīng)過培養(yǎng)，成功建立了兩株來源于楊扇舟蛾胚胎的細胞系，分別命名為CAF-ClanⅠ和CAF-ClanⅡ，現(xiàn)已傳代分別傳到第78代和57代，其合適的培養(yǎng)液為TNM-FH＋10％滅活的胎牛血清，最適宜的pH值是6.4。兩株細胞系的特點為：CAF-ClanⅠ細胞大部分懸浮，有少量貼壁，細胞的形狀有：圓形、梭形和似巨噬形3種；CAF-ClanⅡ的細

5、胞大部分貼壁，主要由圓形和梭形細胞組成。在27℃培養(yǎng)條件下，CAF-Clan I第22代細胞和CAF-Clan II第24細胞的群體倍增時間分別為68.5h和38.2h；兩株細胞系第15代的染色體數(shù)目范圍大部分在62～100之間，也有少數(shù)細胞超過260(n=30)。隨后，運用DAF-PCR方法鑒定了這兩種細胞系表明其來源于楊扇舟蛾。并測定了兩株細胞系對幾種桿狀病毒的敏感性。結(jié)果顯示：CAF-ClanⅡ細胞系對楊扇舟蛾顆粒體病毒（Clan

6、GV）、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）、茶尺蠖核型多角體病毒（EoNPV）三種病毒敏感，所產(chǎn)生AcMNPV和EoNPV的包涵體產(chǎn)量分別為129±4OBs/細胞和124±15 OBs/細胞。出芽型ClanGV（ClanBV）接種CAF-Clan II的TCID50為6.5×105 TCID50/mL。與CAF-ClanⅡ相比，CAF-ClanⅠ細胞系對ClanGV和AcMNPV敏感性稍低，對EoNPV、美國白蛾核型多角體病毒（

7、HcNPV）和春尺蠖核型多角體病毒(AciNPV)不敏感。兩株細胞系長期凍存在－80℃和液氮中并多次成功復(fù)蘇。CAF-Clan I的單細胞克隆正在進行放大培養(yǎng)。
　　研究中，還進行了所培養(yǎng)的細胞系接種、復(fù)制楊扇舟蛾顆粒體病毒的試驗。結(jié)果表明，兩種細胞系接種楊扇舟蛾顆粒體病毒后，在15℃和27℃的溫度條件下，受侵染的細胞系細胞切片在電子顯微鏡下觀察，可見病毒發(fā)生基質(zhì)、核衣殼、病毒粒子和包涵體等不同階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生，但未觀察到包涵體

8、中的單粒包埋病毒粒子，包涵體大小與接種的楊扇舟蛾顆粒體病毒大小一致，表明ClanGV可以侵染CAF-ClanI和CAF-ClanII細胞，但復(fù)制是否完整需要進一步試驗驗證。
　　針對兩株細胞系在幾種培養(yǎng)液中的生長狀況，嘗試配制了一種無血清培養(yǎng)基。目前，CAF-Clan I和CAF-Clan II已在這種培養(yǎng)基中生長了5代。這種改進的無血清培養(yǎng)基的成本是商品化培養(yǎng)基的31.8～47％。
　　論文還對其他8種重要林木害蟲的細胞系

9、培養(yǎng)進行了研究。其中，取自美國白蛾胚胎的一瓶原代培養(yǎng)細胞已經(jīng)成功傳了第4代，有望建成1株新的細胞系。春尺蠖和光肩星天牛等其他林業(yè)昆蟲的原代培養(yǎng)還在進行中。適合美國白蛾和春尺蠖細胞生長的的培養(yǎng)液是IPL-41＋10％FBS。
　　本研究建立了2株新的鱗翅目昆蟲細胞系，豐富了昆蟲細胞系資源；進行了兩種細胞系復(fù)制楊扇舟蛾顆粒體病毒的試驗，表明其對病毒敏感，具有良好的體外復(fù)制該顆粒體病毒的前景；再者，本研究中研制的無血清培養(yǎng)液具有良好的應(yīng)