幾種重要海水養(yǎng)殖魚類細胞系的建立、誘導分化及其應用研究.pdf

1、魚類細胞系的建立始于上世紀60年代，由Wolf和Quimby建立了世界上第一個魚類細胞系．虹鱒生殖腺細胞系RTG-2。隨后，魚類細胞培養(yǎng)工作取得了較大的進展，一些細胞系相繼建立成功。魚類細胞系因材料容易獲得、成本低、重復性好、實驗條件可以精確控制等優(yōu)點，至今已成為一種重要的研究手段，廣泛應用于魚類病毒學等各方面研究。對魚類細胞系進行深入研究無論在理論研究方面還是在實際應用方面都具有深遠意義。 本論文研究了半滑舌鰨(Cynoglo

2、ssus semilaevis)心肌細胞系(HTHC)和圓斑星鰈(Verasper variegates)腎臟細胞系(SHKC)的建立；同時還對半滑舌鰨胚胎細胞系(HEC)和日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎細胞系(FEC)進行了干細胞功能的誘導分化；并將大菱鲆胚胎細胞(TEC)應用于大菱鲆GRIM19基因的功能研究工作上。半滑舌鰨心肌細胞系和圓斑星鰈腎臟細胞培養(yǎng)在添加有20％FBS，1 mM的L-谷氨酸，50

3、 mM的2-ME，100 UI/ml青霉素，100 ug/ml鏈霉素，10 ng/ml bFGF的MEM培養(yǎng)基中，兩種細胞的形態(tài)均為成纖維樣細胞。HTHC細胞至今已傳代30余代；SHKC細胞至今已傳代40余代。本實驗檢測了FBS、bFGF、溫度對HTHC和SHKC細胞生長的影響。在一定范圍內，細胞生長速度隨FBS濃度的增高而加快，F(xiàn)BS濃度過高或過低都抑制細胞的增殖。bFGF對HTHC細胞生長具有刺激作用。HTHC和SHKC細胞在24-

4、30℃之間細胞生長良好，當溫度高于30℃或低于12℃時，細胞生長速度降低。HTHC細胞的二倍體核型為2n=42；SHKC細胞的的二倍體核型為2n=46，將EGFP報告基因通過脂質體(lipofectamine2000)介導的方法成功轉入HTHC和SHKC細胞中并獲得了表達，轉化率為10-15％左右。用牙鲆淋巴囊腫病毒(LCVD)感染HTHC和SHKC細胞，觀察到了細胞病變效應(CPE)，透射電鏡檢測均在細胞內發(fā)現(xiàn)了大量病毒顆粒。

5、 半滑舌鰨胚胎細胞系(HEC)和日本牙鲆胚胎細胞系(FEC)為本實驗室建立保存。HEC和FEC都具有發(fā)育上的多能性，在特定的誘導條件下，都可以誘導分化為纖維細胞、肌肉細胞、神經細胞等各種類型的細胞。全反式視黃酸(RA)、明膠、低濃度FBS均可以誘導兩種胚胎細胞分化為纖維細胞；二甲基亞砜和低密度種植HEC細胞均可以誘導HEC細胞分化為樹狀肌肉細胞；HEC和FEC細胞在低密度條件下均分化為神經細胞、肌肉細胞、上皮細胞；HEC和FEC細胞堿性

6、磷酸酶染色均呈陽性，這些結果初步表明HEC和FEC胚胎細胞具有干細胞的分化特征。將EGFP報告基因通過脂質體(lipofectamine2000)介導的方法成功地轉入HEC和FEC中并獲得了表達；用牙鲆淋巴囊腫病毒(LCDV)感染HEC和FEC細胞，觀察到了細胞病變效應(CPE)，通過透射電鏡觀察到在細胞內有大量病毒顆粒。 我們從大菱鲆脾臟cDNlA文庫中鑒定出-GRIM19基因，并得到該基因的DNA全長。利用RT-PCR技術對

7、該基因進行了在大菱鲆正常組織、不同胚胎發(fā)育階段、鰻弧菌(Vibrio anguillaru，ATCC19019)感染組織和細胞中的表達分析，初步探討了GRIM19基因在魚類先天免疫系統(tǒng)中作用。實驗結果表明：GRIM19全長cDNA含有一個17bp的5'UTR，一個435bp的開放閱讀框(open readingframe，ORF)和一個143bp的3'UTR，開放閱讀框編碼了144個氨基酸殘基。通過比較cDNA序列和基因組序列發(fā)現(xiàn)GRI

8、M19基因內含有5個外顯子和4個內含子?；蚪MSouthern結果表明該基因為單拷貝基因。系統(tǒng)發(fā)生分析表明大菱鲆能夠與大西洋庸鰈聚在一起。該基因在正常大菱鲆免疫系統(tǒng)中表達強烈，尤其是在脾臟和頭腎中；GRIM19在大菱鲆胚胎不同發(fā)育時期表達逐漸增強；在感染頭腎、肝臟、脾臟三種組織中，該基因表達均有增加趨勢：在感染頭腎中該基因表達最強烈，在肝臟感染24h時基因表達達到最高水平，而在脾臟中該基因表達一直增強；鰻弧菌感染大菱鲆胚胎細胞后，GRI