表達三種活化型生長因子細胞系的建立及其內(nèi)耳誘導(dǎo)分化作用的實驗研究.pdf

1、背景:
　　感音神經(jīng)性耳聾是一種常見的感覺障礙性疾病，其中先天性重度感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生率約為千分之一，嚴重困擾著人類的健康、生活與交流。但是，現(xiàn)有的治療手段卻很有限，主要是助聽器和電子耳蝸植入。助聽器對于中度的耳聾有一定效果，但實際上只有五分之一的人才能從中獲益。對于重度感音神經(jīng)性聾，主要依靠電子耳蝸植入，通過插入耳蝸鼓階內(nèi)的電極直接刺激聽神經(jīng)來重建聾人的聽覺功能，全世界已有超過300000患者因此獲益。但它是一種侵入性的手術(shù)治

2、療，在噪聲環(huán)境下的言語識別率還有待進一步提高。助聽器和電子耳蝸只能作為補償手段改善患者聽力，不能從根本上重建受損的聽覺生理功能，逆轉(zhuǎn)患者的聽力水平。近年來生物治療方法在內(nèi)耳細胞保護、修復(fù)和再生方面展現(xiàn)出了巨大的潛能，主要有干細胞移植、基因治療以及生長因子治療等。
　　骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是骨髓中除了造血干細胞以外的另一類具有多系分化潛能、強大自我復(fù)制能力和可移植性的成體干細胞。

3、在適宜的微環(huán)境下，MSCs可以定向誘導(dǎo)分化為多種組織和細胞類型，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞，還可跨胚層分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞、肝細胞等。由于MSCs來源廣泛、容易分離培養(yǎng)、免疫原性低等特點，被廣泛應(yīng)用于細胞移植及基因治療中。
　　生長因子是一種促進特定細胞生長的細胞因子，能和細胞膜表面的特異性受體結(jié)合從而激活細胞內(nèi)信號通路發(fā)揮作用，它們對多種器官的不同類型細胞的存活、增殖、分化都有調(diào)控作用。在內(nèi)耳發(fā)育成熟過程中

4、可檢測到胰島素樣生長因子1(Insulin-like Growth Factor1，IGF1)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)和成纖維細胞生長因子2(Fibroblast Growth Factor2，F(xiàn)GF2)三種生長因子及其受體的表達，這些生長因子可保護內(nèi)耳毛細胞免受損害并促進內(nèi)耳毛細胞的增殖分化。
　　在感音神經(jīng)性耳聾生物治療中，誘導(dǎo)干細胞向內(nèi)耳毛細胞樣細胞分化的研究常采用干細胞與一些

5、特定組織細胞共培養(yǎng)以及添加外源性生長因子的方法。為了將兩種方法結(jié)合用于研究，本文設(shè)計了一種可同時表達三種活化型生長因子的慢病毒載體并用于構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，試圖為干細胞移植結(jié)合生長因子治療感音神經(jīng)性耳聾提供基礎(chǔ)。
　　1、建立表達三種活化型生長因子的細胞系
　　活化型EGF編碼序列采用RT-PCR方法從SW620人大腸癌細胞中克隆，活化型IGF1和FGF2編碼序列為人工合成。用PCR的方法分別從pSecTag2A和pIRES

6、2-EGFP質(zhì)粒中克隆出引導(dǎo)分泌的免疫球蛋白Igκ鏈信號肽編碼序列和引導(dǎo)翻譯的內(nèi)部核糖體進入位點(Internal Ribosome Entry Site，IRES)序列。將Igκ鏈信號肽和三種因子的編碼序列分別融合、由IRES間隔并克隆到帶綠熒光蛋白報告基因的慢病毒表達質(zhì)粒pLVX-IRES-ZsGreenl上并包裝獲得慢病毒。將慢病毒感染HEK293T細胞，通過有限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達綠熒光蛋白的單細胞克隆，命名為HEK293T/3

7、GF。用Western blot檢測單細胞克隆的IGF1、EGF和FGF2的表達，并通過促進肺癌A549細胞生長實驗驗證分泌的生長因子的活性。
　　2、共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)耳毛細胞樣細胞分化
　　利用構(gòu)建成功的可同時表達三種活化型生長因子的HEK293T/3GF細胞與MSCs進行共培養(yǎng)，探索其在內(nèi)耳誘導(dǎo)分化中的作用。采用全骨髓貼壁篩選法分離提取大鼠MSCs，體外培養(yǎng)純化擴增到第四代后，與表達活化型生長因子的HEK2

8、93T/3GF細胞及未轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞進行共培養(yǎng)，并添加維甲酸(RetinoicAcid，RA)，共培養(yǎng)21天后，顯微鏡下觀察MSCs形態(tài)變化，RT-PCR檢測毛細胞相關(guān)標(biāo)記表達情況。HEK293T/3GF與MSCs共培養(yǎng)組與對照組相比，顯微鏡下可觀察到細胞形態(tài)向神經(jīng)細胞樣改變，而且RT-PCR結(jié)果顯示，HEK293T/3GF與MSCs共培養(yǎng)后MSCs表達毛細胞相關(guān)標(biāo)記，說明HEK293T/3GF與MSCs共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)MSCs