缺氧誘導因子-1a和血管內(nèi)皮生長因子在食管鱗癌細胞系ECa-109中的表達及其意義.pdf

1、研究背景：我國是食管癌高發(fā)區(qū)，食管癌校正死亡率達20.4/10萬，居世界首位，主要為食管鱗狀細胞癌，占全部食管癌的95﹪左右。江蘇省是食管癌的高發(fā)地區(qū)，特別是揚中、淮陰等地是全國主要高發(fā)地區(qū)之一。食管癌總的療效和預后較差，對人們健康構(gòu)成極大威脅。近年來國內(nèi)外學者對食管鱗癌進行了大量的基礎(chǔ)研究，特別是血管再生在食管癌發(fā)病機制中的作用。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是重要的血管形

2、成因子，可誘導腫瘤血管形成，維持腫瘤的繼續(xù)生長，大量的研究表明腫瘤患者的預后與腫瘤組織的血管密度明顯相關(guān)，腫瘤組織細胞分泌VEGF的能力是判斷該腫瘤組織細胞的重要生物學特征之一。缺氧誘導因子(hypoxiainduciblefactor,HIFs)是調(diào)節(jié)血管生成的重要活性調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)其下游50余種基因，如VEGF等的表達。施瑞華等對HIF-1a和VEGF在食管鱗癌中的表達及HIF-1a單核苷酸多態(tài)性與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系進行

3、了系列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌組織較正常食管上皮和不典型增生組織中HIF-1a和VEGF有過表達，提示HIF-1a可以上調(diào)VEGF的表達，HIF-1a可能與食管鱗癌血管生成、浸潤能力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。 目的：探討缺氧誘導因子-1a(HIF-1a)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在食管鱗癌細胞系ECa-109中的表達及其意義。 材料和方法：1、材料人食管鱗癌細胞系ECa-109購自中國科學院上海細胞所。小牛血清購

4、自杭州四季青公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；RNA提取試劑Tri-Blue購于上海申能博彩公司；RT-PCR試劑盒購于Fermentas公司；鼠抗人的HIF-1a單抗為Chemicon公司生產(chǎn)；HRP標記的羊抗鼠的二抗為Rockland公司產(chǎn)品；鼠抗人的Tubulin單抗為Sigma公司產(chǎn)品；PVDF膜(微孔性的聚偏乙烯雙氟化物膜)購自Roche公司。其余試劑均為分析純。食管鱗癌ECa-109細胞呈貼壁生長，培養(yǎng)于含10

5、0ml/l小牛血清、100ku/l青霉素和100mg/l鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于含50ml/lCO2的37℃培養(yǎng)箱中。1-2d換液1次，3-4d用2.5g/l胰酶消化傳代1次。缺氧處理：將細胞置于一密封袋中，持續(xù)充以混合氣體(50ml/lO2，100ml/lCO2，100ml/lH2，800ml/lN2)模擬低氧環(huán)境，缺氧時間分別為3，6，12，24，48，72h；相應設置空白對照組。 2、方法2.1RT-PCR檢

6、測HIF-la和VEGF的mRNA的表達Tri-Blue試劑一步法提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書完成各個樣本RNA的抽提純化和cDNA的合成。取總RNA5μl用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴增HIF-1a和VEGF，同時擴增β-actin作為內(nèi)參照。每個樣本至少重復3遍。HIF-1a和VEGF引物用Primer-5軟件根據(jù)引物設計要求自己設計，上游引物為5’-GCAAGACTTTCCTCAGTCGACACA-3’，下游引物為5

7、’-GCATCCTGTACTGTCCTGTGGTGA-3’，擴增片段為207bp；VEGF引物上游為5’-GTCGGGCCTCCGAAACCATGAACT-3’，下游為5’-ATCAGGGGCACACAGGATGGCTTG-3’，擴增片斷為243bp；β-actin引物參照文獻[5]設計合成，上游引物序列為5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3’，下游引物序列為5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’，擴增片段為287

8、bp；引物合成于Invitrogen公司。PCR反應條件：95℃預變性3min，94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸8min。產(chǎn)物于4℃保存。10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。 2.2Western-Blot檢測HIF-1a蛋白的表達取3×105Eca-109細胞加細胞裂解液[20mmol/lTris(pH7.5)，4mmol/lEDTA(pH8.0)，20g/lSDS]150μl裂解細

9、胞制備總蛋白。超聲破碎后12000r/min，離心10min，取上清，用BSA標準蛋白檢測蛋白濃度，取總蛋白40μg上樣，行穩(wěn)流SDS-PAGE電泳，穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜，50g/l脫脂奶粉室溫封閉1h后TBST漂洗3×5min加入鼠抗人HIF-1a單抗(工作濃度1∶500)4℃孵育過夜。TBST漂洗3×5min后再加HRP標記的羊抗鼠二抗(工作濃度為1∶10000)室溫孵育1h，TBST漂洗3×5min。ECL化學發(fā)光法顯影，以T

10、ubulin(工作濃度為1∶4000)為內(nèi)參照。 統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗，P值＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。TanonGis軟件對凝膠電泳條帶和感光膠片條帶進行灰度值分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶的比值代表目的基因mRNA和蛋白的相對表達水平。 結(jié)果：1.HIF-1a和VEGFmRNA在食管鱗癌細胞ECa-109中的表達水平ECa-109細胞中HIF-1amRNA水平在缺氧組較常氧組明

11、顯升高(P＜0.05)，而且在缺氧24h時HIF-1amRNA水平最高，其后隨缺氧時間延長而表達下降；VEGFmRNA的表達水平與HIF-1amRNA表達一致，亦是在缺氧24h時表達最高，24h后表達量逐漸下降(圖2A,3ABC,4AB)。 2.HIF-1a蛋白在食管鱗癌細胞ECa-109中的表達ECa-109細胞中HIF-1a蛋白水平在缺氧狀態(tài)下隨時間延長也有增加，在缺氧24h時水平最高，但是與常氧狀態(tài)下HIF-1a蛋白水平相

12、比差異并無統(tǒng)計學意義；結(jié)果還顯示不管在常氧還是缺氧狀態(tài)下HIF-1a蛋白的表達均存在磷酸化及去磷酸化兩種形式，提示在ECa-109細胞中HIF-1a的蛋白水平調(diào)節(jié)可能發(fā)生在翻譯后的修飾方面(圖2B，5ABC)。 結(jié)論：缺氧誘導因子-1(HIF-1)的表達和活性增強是腫瘤細胞適應缺氧環(huán)境的重要原因。缺氧狀態(tài)下HIF-1a在食管鱗癌細胞ECa-109中有過表達，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平。低氧狀態(tài)下HIF-1amRNA可以上調(diào)其下游基因VE