仔豬斷奶腹瀉性大腸桿菌的多重耐藥性、毒辣力因子分布及特異性蛋黃抗體藥效的研究.pdf

1、仔豬斷奶腹瀉(post-weaning diarrhea，PWD)是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病，主要表現(xiàn)為腹瀉和體重增加減慢，嚴(yán)重時(shí)仔豬脫水、酸中毒甚至死亡。PWD是一種多因子參與的復(fù)雜病癥，但大腸桿菌在一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程中是決定性的環(huán)節(jié)。在不同國(guó)家和地區(qū)、不同年代，PWD病原性大腸桿菌毒力因子可有較大差異。準(zhǔn)確診斷和辨別粘附素等毒力因子類型是有效免疫防治PWD的前提。分離純化病原菌毛等毒力因子作為抗原免疫產(chǎn)蛋母雞防治腸道感染是近年來國(guó)外

2、學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)在PWD病原性大腸桿菌多重耐藥性、毒力因子流行病學(xué)和PWD模型建立及菌毛特異性IgY的藥效評(píng)價(jià)及IgY的合理應(yīng)用方案等方面的研究方面報(bào)道很少。
　　 本研究直腸棉拭采集浙江地區(qū)不同規(guī)?；i場(chǎng)仔豬斷奶腹瀉病料，應(yīng)用微生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定，并采用大腸桿菌專屬引物通過PCR體外擴(kuò)增確認(rèn)，進(jìn)一步通過小鼠致病性試驗(yàn)得到75株病原性大腸桿菌。玻板凝集試驗(yàn)O抗原檢測(cè)結(jié)果表明分離鑒定病原性大腸桿菌O抗原至少覆蓋

3、11種血清型，其中O149、O139、O8為優(yōu)勢(shì)血清型。
　　 采用WHO推薦的Kirby-Bauer法，以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌，以CLSI的臨界濃度為判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)分離的病原性大腸桿菌開展常用抗菌藥物的耐藥性監(jiān)測(cè)，并采用WHONET進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，病原性大腸桿菌耐藥性普遍，其中對(duì)氯霉素(100.0％)、復(fù)方新諾明(86.7％)、多西環(huán)素(82.3％)、鏈霉素(81.8％)的耐藥性很高，對(duì)羧芐西林、多粘菌素B

4、及慶大霉素、環(huán)丙沙星及諾氟沙星的耐藥率也較高，其耐藥率分別高達(dá)69.6％和66.7％、63.6％，56.4％和61.5％。66株大腸桿菌共有36種耐藥譜型，絕大多數(shù)為多重耐藥。對(duì)5種抗菌藥物耐藥的菌株占比例最大(18.18％)，其次是對(duì)6種抗菌藥物耐藥(15.15％)和對(duì)9種抗菌藥物耐藥(12.12％)的菌株；鏈霉素與多類其他抗菌藥存在一定的交叉耐藥性。不同規(guī)?；i場(chǎng)病原大腸桿菌菌株耐藥性存在一定差異。結(jié)果提示，浙江地區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)仔豬斷奶

5、腹瀉大腸桿菌的耐藥性以多重耐藥為主，且對(duì)抗菌藥物的耐藥現(xiàn)象已相當(dāng)嚴(yán)重，在臨床選用藥物進(jìn)行治療時(shí)，應(yīng)充分考慮菌株的耐藥性問題，以免延誤病情造成治療失敗。
　　 采用PCR檢測(cè)Ⅰ型、Ⅱ型整合酶和耐藥基因盒并測(cè)序分析。結(jié)果表明，Ⅰ型整合酶陽(yáng)性菌占檢測(cè)菌株的88.0％(66/75)，Ⅱ型整合酶陽(yáng)性菌占檢測(cè)菌株的17.3％(13/75)。所有Ⅰ型整合酶陽(yáng)性菌株均對(duì)2種以上抗菌藥物耐藥，并且檢測(cè)到Ⅱ型整合酶的菌株中有84.6％(11/13)

6、也檢測(cè)到Ⅰ型整合酶，提示1株細(xì)菌可同時(shí)攜帶多個(gè)整合子。Ⅰ型整合酶陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因盒檢出率為46.7％(35/75)，未檢測(cè)到Ⅱ型整合子基因盒。隨機(jī)取18株耐藥基因盒陽(yáng)性菌，體外擴(kuò)增出產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析，結(jié)果表明，250bp、1.1Kb、1.6Kb、1.7Kb和2.0Kb等5種基因盒片段以7種組合方式存在，含有aadA基因和dfrA等耐藥基因，分別編碼對(duì)鏈霉素和磺胺類藥物的耐藥性，這與耐藥表型檢測(cè)中分離菌多對(duì)這兩類藥物耐藥相符。研究提示，Ⅰ型

7、整合子在介導(dǎo)規(guī)?；i場(chǎng)PWD病原性大腸桿菌多重耐藥中有重要作用。
　　 應(yīng)用菌毛單因子血清對(duì)分離菌進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)和多重PCR技術(shù)分析粘附素及腸毒素類型。結(jié)果表明，PWD病原性大腸桿菌中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)占病原性大腸桿菌分離總數(shù)的67.92％(36/53)；粘附素F4和F18分別占總檢測(cè)菌株數(shù)的24.53％(13/53)和28.30％(15/53)；腸毒素中產(chǎn)STa、STb、STa+STb、LT和SLT-2e分別占總檢

8、測(cè)菌株數(shù)的30.19％(16/53)、35.85％(19/53)、18.9％(10/53)、1.89％(1/53)和9.43％(5/53)。采用PCR對(duì)F4、F18亞型的進(jìn)一步分析表明，大腸桿菌分離株F4ac占76.9％(10/13)，F(xiàn)4ab占23.1％(3/10)；F18分離株均為F18ac(15/15)。研究表明，浙江地區(qū)PWD病原性大腸桿菌以產(chǎn)腸毒素型為主，主要毒力因子包括粘附素F4、F18和腸毒素STa、STb。
　　

9、 以PWD病原性大腸桿菌優(yōu)勢(shì)菌F4菌毛蛋白為抗原，輔以弗氏佐劑，制備免疫原免疫產(chǎn)蛋母雞生產(chǎn)特異性蛋黃抗體。結(jié)果表明，加強(qiáng)免疫后3w，弗氏佐劑組卵黃中效價(jià)可達(dá)4.41g，在弗氏佐劑的輔助下能維持時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9w。卵黃中效價(jià)稍低于血清，但在高水平維持時(shí)間較長(zhǎng)，而PBS組無(wú)論卵黃中還是血清中抗體效價(jià)均低于弗氏佐劑組。研究還表明，以10μg/ml(1ml/只)劑量免疫蛋雞，足以獲得高效價(jià)的抗體。進(jìn)一步采用噴霧干燥、冷凍干燥和沸騰干燥等方法成功制備高

10、免全蛋粉，經(jīng)小白鼠急性毒性試驗(yàn)表明屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。體外抑菌試驗(yàn)表明，抗體效價(jià)≥1:3000時(shí)，IgY能在37℃條件下8h內(nèi)完全抑制F4+ETEC(苗液濃度為104cfu/ml)的生長(zhǎng)繁殖。
　　 采用杜長(zhǎng)大三元雜交斷奶仔豬，通過經(jīng)口灌服ETEC臨床分離強(qiáng)毒株，誘導(dǎo)仔豬發(fā)生腹瀉，建立PWD模型，并考察上述方法研制的特異性蛋黃抗體的藥效。試驗(yàn)分二批進(jìn)行。試驗(yàn)一，采用F4+和F18+ETEC混合攻毒，仔豬按體重窩別隨機(jī)分為①IgY組②

11、(IgY+頭孢唑啉+大觀霉素)組③陽(yáng)性對(duì)照組。試驗(yàn)二，采用F4+ETEC攻毒。仔豬按體重窩別隨機(jī)分為①IgY組②大觀霉素組③陽(yáng)性對(duì)照組。攻毒后每天采取新鮮糞樣用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定大腸桿菌數(shù)。各樣本隨機(jī)取10個(gè)菌落采用三重PCR方法測(cè)定攻毒菌的比例。結(jié)果表明，混合感染兩種ETEC后，第1～6d口服IgY試驗(yàn)組糞便評(píng)分(日平均)為0.43，顯著(P<0.05)低于陽(yáng)性對(duì)照組(1.43)和(IgY+頭孢唑啉+大觀霉素)組(1.36)。試驗(yàn)二中

12、，F(xiàn)4+ETEC攻毒后第1～6d口服IgY試驗(yàn)組糞便評(píng)分(日平均)為0.86，顯著(P<0.05)低于陽(yáng)性對(duì)照組(1.57)和大觀霉素組(1.50)；糞便中大腸桿菌總數(shù)及攻毒菌的排出量方面，無(wú)論是混合感染還是單獨(dú)感染，IgY組仔豬均低于陽(yáng)性對(duì)照組，且排毒持續(xù)時(shí)間短。本研究提示，無(wú)論標(biāo)準(zhǔn)株還是分離株，F(xiàn)4菌毛均具有良好的免疫原性，結(jié)合弗氏佐劑按一定程序免疫母雞，能誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的抗體且能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間并轉(zhuǎn)移至蛋黃中。本試驗(yàn)建立的PWD模型操

13、作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，能用于深入研究PWD發(fā)生發(fā)展機(jī)理和評(píng)價(jià)抗仔豬斷奶腹瀉的藥效。三重PCR具有特異性和較好的靈敏度，能快速檢測(cè)攻毒菌在腸道的排出動(dòng)態(tài)變化。特異性抗體均能有效地控制腹瀉的發(fā)生發(fā)展，有效口服劑量為每次0.3g/kg.bw，3次/d，連續(xù)應(yīng)用3～5d。宜與抗F18菌毛特異性抗體聯(lián)合應(yīng)用，但不宜與抗菌藥物合用。
　　 以上結(jié)果為深入探索PWD病原性大腸桿菌的致病機(jī)理、耐藥機(jī)理和耐藥控制，特異性IgY被動(dòng)免疫防治PWD的研究