真姬菇AFLP分子標記的建立和遺傳多樣性分析及釀酒酵母細胞絮凝主效基因的定位克隆.pdf

1、闡明復雜性狀的遺傳機制是動植物、微生物遺傳改良以及人類復雜疾病致病機理研究的重要基礎。復雜性狀遺傳解析的重點是定位控制復雜性狀遺傳的數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci, QTL)，檢測QTL之間的相互作用，進而鑒定相應的候選基因。QTL定位分析要求整合遺傳標記、表型數(shù)據(jù)和作圖群體遺傳結(jié)構(gòu)3個方面的信息。本研究以真菌作為研究材料，首先從食用真菌真姬菇入手，通過建立AFLP分子標記，為真姬菇遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定

2、位分析奠定基礎；通過菌株遺傳多樣性分析，為揭示真姬菇群體遺傳結(jié)構(gòu)提供第一步參考，并為作圖群體的親本選擇提供可靠依據(jù)。
　　 由于食用菌基因組結(jié)構(gòu)復雜且遺傳信息匱乏，對真姬菇繼續(xù)開展復雜性狀遺傳基礎研究困難重重。為此，接下來本文創(chuàng)造性地利用釀酒酵母這一簡單的模式真核生物對復雜性狀遺傳變異的分子基礎進行解析，通過研究為系統(tǒng)解決數(shù)量遺傳學的核心問題提供分析框架，并為包括真姬菇等食用菌品種在內(nèi)的動植物及微生物復雜性狀研究提供理論和方法參

3、考。
　　 真姬菇(Hypsizygus marmoreus(Peck) H.E.Bigelow)，又稱玉蕈、斑玉蕈、鴻喜菇和蟹味菇等，隸屬于擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬。真姬菇是一種珍稀食用菌品種，具有味道鮮美、營養(yǎng)豐富的食用價值和抗真菌、抗腫瘤等藥用價值，因此具有良好的市場前景。國內(nèi)外對于真姬菇的研究主要集中在營養(yǎng)生理生化和藥理作用等方面，對于真姬菇分子生物學和遺傳學研究鮮有報導。建立有關(guān)真姬菇生產(chǎn)用菌種的分子遺

4、傳標記，并創(chuàng)立相應的菌種檢測標準與方法，是保護我國真姬菇品種知識產(chǎn)權(quán)的重要途徑。
　　 本研究首先旨在建立一套可靠的AFLP（amplified fragment length polymorphism）分子標記實驗方案對真姬菇進行基因分型，并對包括工廠化栽培品種和保藏品種在內(nèi)的19個真姬菇菌株進行DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、真姬菇AFLP分子標記的建立
　　 真姬菇多糖和蛋

5、白含量較高，這為其基因組DNA的提取帶來困難。為了制備符合AFLP標記技術(shù)要求的高質(zhì)量DNA，我們對普遍應用于植物材料的十六烷基三乙基溴化銨（cetyltriethylammonium bromide, CTAB）法進行修改，建立了適合真姬菇的有效的DNA提取方法。
　　 AFLP分析采用的限制性內(nèi)切酶組合是EcoRI和MseI。通過對選擇性堿基種類和數(shù)目以及引物組合進行篩選，最終確定10對引物組合（Eco Rl+2nt/Mse

6、I+3nt）用于多態(tài)性檢測。運用10對引物在19個基因型中共擴增得到609個AFLP標記位點，其中多態(tài)性位點為532個，多態(tài)性比率為87％。每對引物擴增的標記總數(shù)從47到80不等（平均標記數(shù)為60.9），但各引物組合多態(tài)信息量(polymorphic information content,PIC)很高，其中PIC最高達到92％。另外，除去由試驗誤差造成的缺失數(shù)據(jù)，10對引物在19個基因型中共檢測到11184個標記數(shù)據(jù)點。以上數(shù)據(jù)表明：

7、(1)真姬菇物種具有豐富的遺傳差異和遺傳多樣性；(2)10對引物都具備較好的多態(tài)性檢出能力，可作為今后試驗（如遺傳圖譜構(gòu)建）的候選引物；(3)豐富的多態(tài)性位點和標記數(shù)據(jù)點的獲得證明本研究建立的AFLP標記技術(shù)能夠有效地應用于真姬菇的遺傳學研究。
　　 2、19個真姬菇菌株遺傳多樣性評價
　　 采用Dice相似系數(shù)分析和UPGMA法對19個真姬菇菌株的遺傳相似性進行聚類分析。聚類結(jié)果表明，HmC1199等6個菌株在相似系數(shù)

8、大于等于0.95處聚為類群一；另有HmC2637等7個菌株在相似系數(shù)大于等于0.92處聚為類群二；其余6個菌株與兩個類群的遺傳差異相對較大，尤其是菌株HmJ2632與HmC1199的相似系數(shù)僅為0.547。同時，采用主成分分析（principal component analysis, PCA）對19個真姬菇菌株的遺傳多樣性作進一步分析和驗證，第一和第二主分揭示出與UPGMA聚類分析一致的結(jié)果。
　　 將19個真姬菇菌株遺傳分類

9、的結(jié)果與形態(tài)學特征作比較，發(fā)現(xiàn)同一類群的菌株的子實體形態(tài)具有共同特點，如類群一，菇蓋小、菌柄細；類群二，菇蓋大、菌柄短而粗。據(jù)此可以把19個菌株劃分為4個代表類別：即除兩個類群外，還包括白色菇蓋品種(HmJ3136)和瘤蓋品種(HmJ2632)。盡管我們尚不了解真姬菇菇蓋性狀的遺傳基礎，但是克隆這個白色菇蓋品種(HmJ3136)的白化基因并將其與其它菌株正?；蜃鞅容^，無疑將是一個正確的選擇和起點。而瘤蓋品種(HmJ2632)與其余18

10、個菌株遺傳差異非常大，借鑒其他菌種子實體結(jié)實溫度的研究結(jié)論，我們認為，真姬菇可能存在與香菇類似的子實體結(jié)實類型（fruiting season type），其中瘤蓋品種(HmJ2632)可能屬于高溫型，而其余18個菌株則可能分別屬于中溫或低溫型。
　　 目前，在復雜性狀遺傳結(jié)構(gòu)解析方面，人類和動植物作圖群體中有效減數(shù)分裂量的匱乏極大地限制了QTL定位的解析率，研究者將目光更多地投向模式生物。釀酒酵母（Saccharomyces

11、cerevisiae）是適用于數(shù)量遺傳學研究的一個重要的真核模式物種。酵母絮凝是一個可逆的、無性的且依賴于鈣離子的過程，是指酵母細胞之間相互粘附形成聚集體(flocs)。絮凝特性與乙醇發(fā)酵生產(chǎn)密切相關(guān)，具有重要的工業(yè)應用價值。研究表明，酵母FLO基因家族的多個FLO基因的遺傳變異和表達修飾可以導致絮凝表型的差異，這反映了絮凝這一性狀受多基因控制的復雜遺傳本質(zhì)。本研究采用正向遺傳學方法揭示釀酒酵母自然群體中細胞絮凝發(fā)生遺傳變異的分子基礎，

12、通過研究為包括真姬菇等食用菌品種在內(nèi)的動植物及微生物復雜性狀研究提供理論和方法參考，并為用于發(fā)酵工業(yè)的酵母菌株的遺傳改良提供可靠的理論依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1、選擇兩個絮凝表型變異極其顯著的酵母菌株YH1A（非絮凝）和YL1C（絮凝）作為親本，通過兩親本雜交構(gòu)建了由292個子代個體組成的F2代單倍體分離群體(Huetal.，2007)。同時，構(gòu)建了以260個微衛(wèi)星標記(STR)為主（Hu etal.，2

13、007）、24個SNP標記為補充的酵母全基因組飽和分子標記連鎖圖譜，標記平均間隔在10-20cM范圍內(nèi)；
　　 2、建立了一套簡便可靠的實驗方法對親本及子代個體進行絮凝表型測定。以液體培養(yǎng)基中細胞沉淀至管底所用時間(T)作為判定標準，并以兩個親本作為對照，絮凝表型一共劃分為四大類：第1類(T=0)；第Ⅱ類(0＜T＜=2.5)；第Ⅲ類(2.5＜T＜12.5)和第Ⅳ類(T＞＝12.5)。沉淀時間越長，絮凝程度越低。親本YH1A和YL

14、1C分別屬于第Ⅳ類和第Ⅱ類，第1類個體表現(xiàn)出極端絮凝的超親分離現(xiàn)象。第1類至第Ⅳ類表型對應的子代個體數(shù)分別是30、23、103和136個。由此，本研究將酵母絮凝作為一個具有多個閾值的分類性狀進行處理；
　　 3、采用多區(qū)間作圖法定位到4個顯著的QTL，它們分別位于1號、2號、5號和15號染色體上。1號和5號染色體QTL區(qū)域分別包含一個已知的FLO基因FLO1和FLO8。通過精細定位，2號染色體QTL區(qū)域分解為6個候選基因，而15

15、號染色體QTL區(qū)域則包含8個候選基因；
　　 4、通過基因敲除、序列多態(tài)性分析、等位基因置換和定點突變等一系列試驗，確證了位于2號染色體QTL區(qū)域的FPQ2是導致絮凝表型變異的一個主效基因。序列多態(tài)性分析和多序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個親本YH1A和YL1C的FPQ2編碼區(qū)存在3個引起氨基酸錯義突變的核苷酸變異，其中一個突變位點m3(D368V)在絮凝親本YL1C和7個其它酵母菌中具有高度保守性。經(jīng)過定點突變和突變型等位基因置換，我們

16、發(fā)現(xiàn)YL1C來源的m3位點能夠幾乎完全重建YL1C背景FPQ2基因敲除菌株的絮凝表型，可見m3位點的核苷酸多態(tài)是控制酵母絮凝的一個數(shù)量性狀核苷酸(QTN)。因此，F(xiàn)PQ2基因編碼區(qū)的DNA結(jié)構(gòu)變異是導致表型變異的一個重要原因。定量PCR和Western印跡分析結(jié)果表明，在兩個親本中FPQ2基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達量都存在顯著差異。采用與研究FPQ2相似的方法，我們鑒定出位于15號染色體QTL區(qū)域的FPQ15也是一個絮凝主效基因；

17、　　 5、本研究最終確定了4個絮凝QTL基因，包括兩個新基因：FPQ2和FPQ15，以及兩個已知的FLO基因：FLO1和FLO8，這些基因與3個方面有關(guān)：細胞發(fā)育（FPQ15）、子細胞行為（FPQ2）以及細胞表面黏附特性（FLO1和FLO8。其中，F(xiàn)PQ2的遺傳變異能夠解釋絮凝表型變異的25％，而FLO8、FLO1和FPQ15分別解釋表型變異的17％、11％和5％，4個基因型組合在一起能夠解釋表型變異的46％。為了說明QTL基因的互作

18、效應，我們根據(jù)每個子代個體的等位基因來源以及4個QTL基因型組合將292個個體分為16組。我們注意到，相比基因型為“----”（即4個等位基因FPQ2、FLO8、FPQ15和FLO1都來自YL1C）的一組個體，基因型“---+”（“+”表示等位基因來自YH1A）的一組中具有更大比例的個體表現(xiàn)出極端絮凝的表型。這就表明FLO1促進絮凝的等位基因是來自YH1A親本的，也解釋了分離群體中的超親分離現(xiàn)象。QTL基因不同的等位基因組合使個體的表型