基于Bmamy2基因的家蠶起源與分化研究.pdf

1、家蠶的起源與分化不僅是基礎(chǔ)科學(xué)問題，也是有關(guān)蠶業(yè)發(fā)生歷史和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大實踐問題，其研究不僅具有重要的理論價值，而且對家蠶的品種鑒定、基因資源利用、雜種育種等產(chǎn)業(yè)實踐具有重要指導(dǎo)意義。自印度昆蟲學(xué)家霍頓提出家蠶的種源問題后，逐漸引起各國學(xué)者的注意。自1915年日本學(xué)者青木清首先用血清沉淀反應(yīng)研究家蠶與野蠶的親緣關(guān)系始，近一個世紀(jì)以來，中外學(xué)者，特別是中日學(xué)者從文獻(xiàn)學(xué)、氣候?qū)W、古生物學(xué)、生態(tài)地理學(xué)、考古學(xué)、遺傳學(xué)、生理生化學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子

2、標(biāo)記（RAPD、AFLP、SSR等）、DNA序列分析等多角度、多層次進(jìn)行了廣泛、深入的探索，取得重要研究成果。首先明確并達(dá)成一致共識：家蠶來源于野桑蠶，中國野蠶是家蠶的直系祖先，日本野蠶與中國野蠶存在較大的遺傳分化，對家蠶的起源沒有直接貢獻(xiàn)；家蠶最早起源于中國，野蠶在中國被馴化成家蠶后向世界各地傳播，各地地理氣候和人文社會環(huán)境不同，經(jīng)過長期的生殖隔離、自然選擇和人工定向選育，逐漸形成了不同的地理系統(tǒng)和生態(tài)類型。但是，在家蠶的起源地域和分

3、化模式上，不同學(xué)者使用不同的技術(shù)手段、實驗材料和分析方法，得出不同的結(jié)論，影響較大的主要有三種觀點：一是以日本學(xué)者吉武成美教授為代表，基于家蠶地方品種多種酶系的同工酶多態(tài)性提出的“一化性一中心學(xué)說”：二是以我國學(xué)者蔣猷龍教授為代表的“多化性多中心學(xué)說”，其學(xué)術(shù)依據(jù)主要是古生物學(xué)、古氣候?qū)W和考古學(xué)資料；三是西南大學(xué)魯成教授依據(jù)現(xiàn)代分子標(biāo)記研究提出的“混化性起源學(xué)說”。 DNA是直接的遺傳物質(zhì)，所提供的遺傳信息比其它形態(tài)標(biāo)記、生化

4、標(biāo)記更加準(zhǔn)確可靠。DNA序列分析通過測定核酸一級結(jié)構(gòu)中核苷酸組成和排列順序來比較同源分子之間的相關(guān)性，其揭示的遺傳信息比其它分子標(biāo)記更加豐富和詳細(xì)，在生物的起源進(jìn)化研究特別是短期馴化物種的起源進(jìn)化研究上具有明顯的優(yōu)勢，是目前分子進(jìn)化及系統(tǒng)發(fā)育研究最有效、最可靠的方法。家蠶馴化時間短，且研究的是物種內(nèi)不同類型間的親緣關(guān)系，特別需要一個快速進(jìn)化的基因作為檢測標(biāo)記。淀粉酶在豬、綿羊、家蠶及果蠅等多個物種中表現(xiàn)出較高的同工酶譜多樣性及核苷酸多態(tài)

5、性，廣泛用于進(jìn)化研究。本研究通過生物信息學(xué)分析、文獻(xiàn)研究和序列測定確證Bmamy2是一個快速進(jìn)化、多態(tài)性豐富的基因，且具有合適的基因結(jié)構(gòu)，便于同時利用外顯子和內(nèi)含子攜帶的遺傳信息進(jìn)行綜合分析，結(jié)論更加全面、可靠。實驗以大量典型家蠶地方品種和有代表性的野蠶地理類型為材料，以Bmamy2基因為標(biāo)記，通過DNA序列多態(tài)性探索家蠶的起源與分化模式，獲得的主要結(jié)果如下： 1．α-淀粉酶基因的生物信息學(xué)分析 α-淀粉酶是一個與生命活

6、動緊密相關(guān)的多基因家族，在不同物種中具有不同的基因結(jié)構(gòu)和分布特點。在三刺魚、非洲爪蟾、雞以及人等脊椎動物中，物種問和物種內(nèi)不同基因拷貝聞具有保守的基因結(jié)構(gòu)，分布在一條染色體上，存在較多的重疊基因；物種內(nèi)不同基因拷貝間氨基酸序列相似性極高，物種間序列相似性低。而在果蠅、蚊子和家蠶等昆蟲中，α-淀粉酶基因沒有類似的保守結(jié)構(gòu)和重疊基因，不同拷貝以串連形式分布在多條染色體上；物種內(nèi)和物種間不同基因拷貝間序列相似性較低。在秀麗隱桿線蟲等低等生物基

7、因組中只有一個α-淀粉酶基因拷貝，在昆蟲、哺乳動物等高等生物中發(fā)生了顯著的基因擴(kuò)增，基因數(shù)量明顯增加。脊椎動物中各淀粉酶基因嚴(yán)格按物種聚類，物種間沒有交叉，推測基因擴(kuò)增發(fā)生在物種分化之后。昆蟲中，α-淀粉酶基因起源進(jìn)化關(guān)系復(fù)雜，蚊子和果蠅同屬雙翅目，但基因拷貝數(shù)相差很多，表明兩物種分化形成后蚊子中發(fā)生了顯著的基因擴(kuò)增；嗜鳳梨果蠅和黑腹果蠅同屬果蠅科，親緣關(guān)系很近，在兩物種分化形成后，鳳梨果蠅又發(fā)生了基因擴(kuò)增，形成相對較多的基因拷貝。蚊子

8、和家蠶雖然分屬不同的目，但兩者的α-淀粉酶基因卻表現(xiàn)出較為相似的分化模式；各物種中α-淀粉酶基因都聚類成彼此間遺傳差異較大的兩族，其中一族與細(xì)菌具有較近的遺傳距離；物種分化形成后發(fā)生了基因擴(kuò)增事件，形成較多的基因拷貝。家蠶Bmamy2、Bmamy3，Bmamy4三個基因在同一染色體上緊鄰著串連排列，且具有及其相似的基因結(jié)構(gòu)，可能通過基因重復(fù)而產(chǎn)生，但三個基因的核苷酸序列差異顯著，推測三基因經(jīng)受了不同的進(jìn)化選擇。 2．家蠶Bmam

9、y2基因的克隆、表達(dá)及序列分析 克隆測序了家蠶Bmamy2基因編碼區(qū)序列，是家蠶基因組中第一個有實驗證據(jù)的淀粉酶基因序列。家蠶Bmamy2基因CDS全長1752bp，除起始密碼子外，編碼583個氨基酸，有8個內(nèi)含子，其中第一、第六、第七和第八內(nèi)含子較長，分別為393bp、505bp、647bp和1828bp，其余均在100bp左右；除第四外顯子較長外（582bp），其余外顯子均小于100bp；外顯子/內(nèi)含子邊界符合GT-AG規(guī)則

10、。芯片數(shù)據(jù)和RT-PCR檢測一致表明Bmamy2在家蠶幼蟲中腸和脂肪體中表達(dá)，且中腸中表達(dá)量極高，脂肪體中表達(dá)量較低，在頭部、表皮、血液、絲腺、精巢和卵巢等組織中不表達(dá)。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)催化中心的兩個關(guān)鍵氨基酸發(fā)生突變（D258Y，D423P），該酶可能已失去催化水解碳水化合物的功能。Bmamy2基因在細(xì)菌等微生物中存在直系同源基因，堿基變異豐富，家蠶地方品種中堿基突變率5．6％，野蠶中堿基突變率8．3％，遺傳多樣性高，沒有明顯的堿基

11、使用偏好和特別長的內(nèi)含子間隔，是家蠶多樣性檢測較好的標(biāo)志基因。 3．家蠶的種群結(jié)構(gòu)及遺傳分化 雖然按地理系統(tǒng)和生態(tài)類型取樣，但系統(tǒng)發(fā)育分析并未檢測到按系統(tǒng)或生態(tài)類型聚類的結(jié)果，分子方差分析也未檢測到按系統(tǒng)或生態(tài)類型歸類的組群結(jié)構(gòu)。90個家蠶地方品種聚類成三大簇群，每一簇群均由來自不同系統(tǒng)和生態(tài)類型的品種構(gòu)成，歸屬同一地理系統(tǒng)或生態(tài)類型的品種分布在不同的聚類枝上。三大簇群間存在較大的遺傳距離。簇群內(nèi)不同品種間遺傳差異小。推

12、測三大簇群分別來自三個獨立的馴化起源。 4．野蠶的多樣性及地理種群結(jié)構(gòu) 野蠶是一個在東南亞地區(qū)尤其是中國廣泛分布的物種，具有一化性、二化性及多化性等多種生態(tài)類型，在眠性上有三眠蠶、四眠蠶及少數(shù)的五眠蠶。野蠶的多樣性在形態(tài)特征、生態(tài)類型、發(fā)育生理、食性、抗性及多種分子標(biāo)記等各個方面和層次得到充分體現(xiàn)?；贐mamy2基因部分區(qū)段的序列分析，不同個體間堿基突變率高達(dá)8．3％，內(nèi)含子區(qū)域更高達(dá)10．8％，單倍型多樣度h=0．9

13、87±0．023，核苷酸多樣性π=0．022814±0．0034。野蠶的生態(tài)學(xué)特征之一是群體發(fā)育極不整齊，典型的現(xiàn)象是越年卵孵化的長期化和蛹期發(fā)育的多樣化，發(fā)育早的已完成一個世代，而發(fā)育遲的尚未出殼，造成世代重疊。分子方差分析顯示，野蠶沒有形成穩(wěn)定的地理組群結(jié)構(gòu)，彼此間親緣關(guān)系的疏密與空間距離的遠(yuǎn)近沒有必然聯(lián)系。聚類分析中，來自不同地區(qū)的野蠶同聚在相同的聚類枝上，表現(xiàn)較近的親緣關(guān)系；而同一地區(qū)的個體卻分布于不同聚類枝上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。各

14、地野蠶是多種眠性和生態(tài)類型混棲的混雜群體。 5．家蠶的起源與分化 基于Bmamy2基因的序列多態(tài)性，應(yīng)用系統(tǒng)發(fā)育分析、Network分析、AMOVA分析等多種分析方法，檢測到一致的系統(tǒng)發(fā)育模式。90個家蠶和野蠶樣本混合聚集成不同的聚類簇群，每一簇群都同時由家蠶和野蠶組成，家蠶來自不同的地理系統(tǒng)和生態(tài)類型；簇群間具有較大的遺傳距離，簇群內(nèi)的不同品種間遺傳差異較小。不同系統(tǒng)或生態(tài)類型的家蠶品種具有相似的分化程度，與野蠶間具有

15、相似的遺傳距離，應(yīng)當(dāng)具有相似的馴化起源時間，經(jīng)歷了相似的分化歷程，而各地野蠶又是多種類型的混雜群體，推測從野蠶到家蠶的馴化當(dāng)是由多種類型的野蠶同時開始的。聚類簇群間較大的遺傳距離表明不同簇群可能具有不同的起源背景和進(jìn)化經(jīng)歷，來源于不同的地理區(qū)域。即，家蠶很可能是在幾個不同地域由多種生態(tài)類型混雜的野蠶馴化而成的，起源之初就有多種化性的遺傳背景，家蠶的起源為“混化性多地域”模式。多種化性的家蠶向世界各地傳播，適應(yīng)當(dāng)?shù)氐淖匀粴夂蚝腿斯みx擇，逐