家蠶血細(xì)胞特異標(biāo)記BmintegrinαPS3的鑒定及BmUsh基因的造血分化調(diào)控研究.pdf

1、家蠶為鱗翅目的模式昆蟲，其整個(gè)體腔都處在循環(huán)血淋巴中。根據(jù)形態(tài)的不同，家蠶血細(xì)胞分為五種類型:原血細(xì)胞，顆粒細(xì)胞，漿細(xì)胞，擬絳色細(xì)胞和小球細(xì)胞，但各種血細(xì)胞在體內(nèi)的增殖分化及發(fā)育形成過程仍不清楚。
　　 本研究利用細(xì)胞增殖分子標(biāo)記對(duì)家蠶幼蟲時(shí)期血細(xì)胞的增殖進(jìn)行系統(tǒng)分析。基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫篩選并鑒定得到家蠶顆粒細(xì)胞的一個(gè)特異性分子標(biāo)記BmintegrinαPS3，利用其表達(dá)特性追蹤家蠶顆粒細(xì)胞的來源，并探討顆粒細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的

2、參與過程?？寺¤b定家蠶造血作用調(diào)控因子BmUsh基因，并分析其對(duì)造血作用的調(diào)控功能。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶幼蟲血細(xì)胞的增殖
　　 (1)家蠶循環(huán)血細(xì)胞的增殖:利用BrdU、PHH3及Tubulin抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)家蠶5齡幼蟲的循環(huán)血淋巴中不斷有血細(xì)胞發(fā)生DNA復(fù)制，同時(shí)進(jìn)入到細(xì)胞分裂。除了小球細(xì)胞，其他4種循環(huán)血細(xì)胞:原血細(xì)胞、漿細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、擬絳色細(xì)胞均能被BrdU標(biāo)記。血細(xì)胞增殖率從5齡起蠶到

3、5齡盛食期逐步增高;在5齡5天時(shí)，為了給變態(tài)時(shí)期準(zhǔn)備足夠數(shù)量的血細(xì)胞，增殖率達(dá)到5齡時(shí)期的最大值;從5齡6天到上蔟一天，增殖率一直維持在一個(gè)較高的水平。使用滅活的大腸桿菌誘導(dǎo)家蠶5齡幼蟲進(jìn)行細(xì)胞免疫，總體細(xì)胞的增殖率增高，進(jìn)行吞噬反應(yīng)中的血細(xì)胞也能發(fā)生增殖。
　　 (2)家蠶造血器官的結(jié)構(gòu)、形態(tài)變化:造血器官位于翅原基中央，周圍由脂肪體組織包裹。以大造為實(shí)驗(yàn)材料，利用DAPI染料對(duì)L5D1到L5D7的造血器官進(jìn)行全組織染色，觀察

4、發(fā)現(xiàn)造血器官體積從5齡1天到5齡6天逐漸增大，而到5齡7天時(shí)，造血器官體積急劇減小，通過細(xì)胞凋亡檢測(cè)及體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，5齡末期造血器官的減小主要是由于造血器官內(nèi)的血細(xì)胞大量釋放到循環(huán)血淋巴中，而非細(xì)胞凋亡。
　　 (3)家蠶造血干細(xì)胞及造血前體細(xì)胞的鑒定:利用哺乳動(dòng)物中干細(xì)胞鑒定的方法，延長(zhǎng)BrdU體內(nèi)標(biāo)記時(shí)間進(jìn)行BrdU滯留標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)家蠶循環(huán)血細(xì)胞中存在兩種能被BrdU標(biāo)記上的細(xì)胞:一種是能被BrdU長(zhǎng)期標(biāo)記上的血細(xì)胞，該細(xì)

5、胞中的BrdU信號(hào)飽滿，細(xì)胞周期緩慢，為潛在的造血干細(xì)胞;另一種是能被BrdU短期標(biāo)記上的血細(xì)胞，它們能夠不斷地分裂導(dǎo)致BrdU信號(hào)被稀釋，這一類細(xì)胞為造血前體細(xì)胞。對(duì)造血器官內(nèi)的血細(xì)胞進(jìn)行BrdU滯留標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)造血器官內(nèi)血細(xì)胞分裂十分活躍，且其中增殖的血細(xì)胞不斷排入到循環(huán)血細(xì)胞中，造血器官中的血細(xì)胞作為造血前體細(xì)胞不斷地參與到幼蟲的造血過程中。
　　 2.家蠶顆粒細(xì)胞的標(biāo)記物鑒定及其免疫功能研究
　　 (1)Bmi

6、ntegrinαPS3的克隆及序列分析:通過對(duì)家蠶基因組芯片數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，篩選發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)基因BGIBMGA006624在血液組織中特異性地高量表達(dá)。通過預(yù)測(cè)序列及RACE技術(shù)，克隆得到包括其完整ORF的cDNA序列。該基因位于10號(hào)染色體的nscaf2855上，DNA全長(zhǎng)為25988bp，含有25個(gè)外顯子和24個(gè)內(nèi)含子。ORF框長(zhǎng)為2895bp，編碼965aa，預(yù)測(cè)蛋白分子量為107.1kDa，等電點(diǎn)為5.16，含有整合素家族保守的in

7、tegrinα結(jié)構(gòu)域，N端含有一個(gè)20aa的信號(hào)肽，在C端有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域。3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白從24到596氨基酸的胞外域能形成一個(gè)屈膝結(jié)構(gòu)。對(duì)各物種中的integrinα同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果顯示該蛋白與組織特異表達(dá)性的PS3亞家族蛋白聚為一類，所以命名為BmintegrinαPS3。
　　 (2)BmintegrinαPS3基因的表達(dá)分析:利用RT-PCR及qRT-PCR檢測(cè)Bmintegrin

8、αPS3基因在家蠶5齡3天各組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其除了在頭部微弱表達(dá)以外，在血細(xì)胞特異并高量表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)BmintegrinαPS3基因在5齡各時(shí)期血細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量從4齡眠期開始逐漸增高，在5齡6天時(shí)達(dá)到最高值，L5D7至變態(tài)期，都維持在一個(gè)較高的表達(dá)水平。
　　 (3)BmintegrinαPS3的血細(xì)胞標(biāo)記:原核誘導(dǎo)表達(dá)并純化制得BmintegrinαPS3重組蛋白，通過免疫新西蘭兔后制得免疫血清。利用免疫

9、血清進(jìn)行Westemblotting檢測(cè)原核誘導(dǎo)產(chǎn)物，結(jié)果顯示免疫血清能夠特異識(shí)別重組表達(dá)的BmintegrinαPS3蛋白。Westernblotting檢測(cè)家蠶循環(huán)血細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)免疫血清能夠識(shí)別兩個(gè)大小不同的蛋白亞型，并且分子量較小的一條帶定位于細(xì)胞膜上。免疫熒光檢測(cè)家蠶循環(huán)血細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)免疫血清在體內(nèi)能夠特異識(shí)別家蠶循環(huán)血液中的顆粒細(xì)胞。通過與Tubulin抗體共染，顯示BmintegrinαPS3的信號(hào)主要位于家蠶體內(nèi)顆粒細(xì)胞細(xì)胞膜

10、上，呈點(diǎn)狀分布，推測(cè)該蛋白在體內(nèi)執(zhí)行功能時(shí)主要位于細(xì)胞膜上。
　　 (4)BmintegrinαPS3蛋白的亞細(xì)胞定位變化:為了進(jìn)一步鑒定BmintegrinαPS3蛋白的表達(dá)特性，構(gòu)建家蠶BmintegrinαPS3全長(zhǎng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入家蠶胚胎細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)BmintegrinαPS3-EGFP融合蛋白均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中。將3個(gè)Bmintegrinβ因子全長(zhǎng)表達(dá)載體分別與BmintegrinαPS3全長(zhǎng)表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染時(shí)，發(fā)現(xiàn)有

11、β亞基存在時(shí)，BmintegrinαPS3能夠聚集到β亞基所在之處。尤其是6150β亞基能夠完全招募所有的BmintegrinαPS3分子，構(gòu)成αPS3β6150二聚體。以上結(jié)果顯示，αPS3亞基的定位在體內(nèi)可能存在兩種表達(dá)形式，一種是在沒有β亞基等因子的情況下，其表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)中，另外一種則是在有β亞基等因子的情況下有，αPS3亞基能夠被活化形成一個(gè)較小分子量的蛋白，定位于細(xì)胞膜上。
　　 (5)家蠶顆粒細(xì)胞的來源:利用RT

12、-PCR及qRT-PCR檢測(cè)BmintegrinαPS3基因在家蠶各時(shí)期胚胎的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)胚胎第7天，BmintegrinαPS3開始表達(dá)，直到胚胎末期都維持一個(gè)較高的表達(dá)水平，說明顆粒細(xì)胞在胚胎第7天逐漸開始產(chǎn)生，之后一直存在于循環(huán)血淋巴中。通過造血器官的體外培養(yǎng)及剝離實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)造血器官中的血細(xì)胞在排到循環(huán)血淋巴后，一部分細(xì)胞能分化形成顆粒細(xì)胞。
　　 (6)家蠶顆粒細(xì)胞的免疫功能:對(duì)家蠶幼蟲注射凝膠珠后發(fā)現(xiàn)Bmintegr

13、inαPS3的表達(dá)量在注射3h時(shí)就已經(jīng)上調(diào)表達(dá)，在12h-24h時(shí)，維持在一個(gè)顯著性增高的表達(dá)水平;在48h時(shí)，其表達(dá)量降低到接近正常的水平。對(duì)家蠶幼蟲注射滅活后的大腸桿菌后發(fā)現(xiàn)BmintegrinαPS3的表達(dá)量在6h時(shí)，就已經(jīng)大幅度地增加，而到12h時(shí)微弱地降低，在24h時(shí)，已經(jīng)接近于正常的水平。以上實(shí)驗(yàn)說明顆粒細(xì)胞作為細(xì)胞免疫的主要成員能參與到包囊反應(yīng)及吞噬反應(yīng)中，在進(jìn)行包囊反應(yīng)時(shí)，過程相對(duì)較長(zhǎng)，而在進(jìn)行吞噬反應(yīng)時(shí)，能迅速地參與并

14、完成吞噬反應(yīng)。
　　 3.家蠶造血作用因子的克隆及功能鑒定
　　 (1)BmUsh的克隆及序列分析:通過家蠶基因組數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)序列及RACE技術(shù)，克隆得到家蠶BmUsh基因完整的cDNA序列。該基因位于4號(hào)染色體上，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。ORF框長(zhǎng)為2409bp，編碼803aa，預(yù)測(cè)分子量為85.89kDa，等電點(diǎn)為8.3。BmUsh含有8個(gè)典型的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于FOG蛋白家族成員。對(duì)各物種FOG同源序

15、列進(jìn)行多序列比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果顯示，F(xiàn)OG從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物都是保守的，各種昆蟲中的FOG成員都只有Ush，而由于長(zhǎng)期進(jìn)化的原因，在哺乳動(dòng)物的形成過程中，F(xiàn)OG基因也發(fā)生了擴(kuò)增，存在兩個(gè)FOG同源基因FOG-1，F(xiàn)OG-2。
　　 (2)BmUsh基因的表達(dá)分析:BmUsh基因從胚胎第1天開始至胚胎第4天表達(dá)量逐漸降低，胚胎第5天至胚胎第9天幾乎不表達(dá)。在家蠶5齡3天各組織中均有表達(dá)，但在血細(xì)胞中的表達(dá)量顯著性地高于其

16、他組織。檢測(cè)BmUsh基因在5齡各時(shí)期血細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示BmUsh基因在眠期、盛時(shí)期、上蔟時(shí)期都上調(diào)表達(dá)。
　　 (3)BmUsh核定位信號(hào)鑒定:Ush作為轉(zhuǎn)錄因子定位到細(xì)胞核內(nèi)，通過序列分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)BmUsh蛋白中450-459這10個(gè)位點(diǎn)的氨基酸中有4個(gè)精氨酸的串聯(lián)，為典型的核定位信號(hào)基序。將這一基序與DsRed共同構(gòu)建到瞬時(shí)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞系后，發(fā)現(xiàn)DsRed能夠完全定位到細(xì)胞核中。同時(shí)將4個(gè)精氨酸逐一

17、進(jìn)行點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)第1位和第3位精氨酸突變后核定位信號(hào)能力完全丟失，DsRed定位在了細(xì)胞質(zhì)中。以上結(jié)果說明450-459這10個(gè)位點(diǎn)的氨基酸為BmUsh的核定位信號(hào)，其中456和458位精氨酸起著不可缺少的作用。
　　 (4)BmUsh的相互作用因子:為了進(jìn)一步尋找到BmUsh蛋白的相互作用因子，構(gòu)建了家蠶BmUsh全長(zhǎng)表達(dá)載體，BmUsh-DsRed融合蛋白完全表達(dá)定位于細(xì)胞核中。同時(shí)將BmUsh全長(zhǎng)蛋白中456和458位的精

18、氨酸進(jìn)行點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)突變蛋白都不能正常進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)。說明該位點(diǎn)精氨酸在全長(zhǎng)蛋白中確定決定著核定位信號(hào)。將另外一個(gè)造血作用因子BmLz全長(zhǎng)表達(dá)載體與BmUsh全長(zhǎng)表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染時(shí)，發(fā)現(xiàn)BmLz蛋白能與正常的BmUsh蛋白共同定位表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi);同時(shí)將BmLz全長(zhǎng)表達(dá)載體分別與BmUsh突變載體共同轉(zhuǎn)染時(shí)，發(fā)現(xiàn)BmLz蛋白能將BmUsh突變蛋白由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)遷移到細(xì)胞核內(nèi)，但也有非常少數(shù)的情況，Lz蛋白能被BmUsh點(diǎn)突變蛋白召集到細(xì)胞質(zhì)中

19、。利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體同時(shí)高量表達(dá)BmUsh和BmLz的融合蛋白，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)直接證明了BmUsh和BmLz能夠相互作用。綜上，推測(cè)BmLz蛋白為BmUsh蛋白的相互作用因子，能夠在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮重要的功能。
　　 (5)BmUsh的造血作用調(diào)控功能:在原代培養(yǎng)的循環(huán)血細(xì)胞中轉(zhuǎn)染BmUsh全長(zhǎng)表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)BmUsh融合蛋白在家蠶血細(xì)胞中表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。觀察對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞100％為漿細(xì)胞，而與之相比B

20、mUsh融合蛋白所表達(dá)的血細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了形態(tài)上的變化，類似于體外培養(yǎng)的擬絳色細(xì)胞。推測(cè)BmUsh蛋白在漿細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)之后，促進(jìn)漿細(xì)胞分化成為擬絳色細(xì)胞。
　　 合成雙鏈RNA后注射5齡5天家蠶幼蟲，mRNA表達(dá)水平檢測(cè)顯示BmUsh被成功下調(diào)表達(dá)，同時(shí)黑化效應(yīng)因子PPO1，PPO2及其上游的激酶PPAE及BAEE在血細(xì)胞中的表達(dá)量同樣也被下調(diào)。在表型上，發(fā)現(xiàn)注射BmUsh干涉組的蠶體血淋巴不能正常進(jìn)行黑化反應(yīng)。以上結(jié)果與前