大麥黃矮病毒運動蛋白在煙草中的瞬時表達及其功能研究.pdf

1、近些年來,隨著生物信息學、結構和功能基因組學研究的不斷深入,利用病毒載體在植物中表達外源基因已經(jīng)成為了生命科學領域的研究熱點之一。隨著載體構建策略的不斷完善,多種病毒已被用于構建不同類型的載體,從而表達各種不同目的的外源基因,而最有價值的用途是用于商業(yè)化生產(chǎn)一些蛋白質或多肽,尤其是利用植物病毒作為表達載體系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗或藥用蛋白。本研究中所利用的病毒載體是馬鈴薯X病毒載體(Potato virus X,PVX),它具有轉化途徑簡單、可快速

2、得到高拷貝的外源基因等優(yōu)點,因此,近年來無論在基礎研究上還是應用研究上都得到了廣泛的重視。
　　農(nóng)桿菌介導的瞬時表達體系是一種在植物中快速、大量表達基因的實用系統(tǒng)。本研究運用了該系統(tǒng)以大麥黃矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus, BYDV)的運動蛋白(Movement Protein, MP)為研究對象,建立了以農(nóng)桿菌轉化和滲透注射技術為基礎的植物病毒載體介導的外源基因表達的技術體系,對外源基因的表達進行了初

3、步的檢測分析,并獲得了較好的實驗結果。研究以BYDV-PAV的全長cDNA為模板,根據(jù)Genebank中登記的BYDV-MP的基因序列設計引物,通過PCR擴增得到目的基因片段BYDV-MP,然后定向克隆到馬鈴薯X病毒載體pGR107上,得到了重組的馬鈴薯X病毒載體,然后電擊轉化農(nóng)桿菌,利用農(nóng)桿菌滲透注射技術注射到煙草葉片,分析了外源基因BYDV-MP在植物體內的瞬時表達狀況。
　　研究結果:農(nóng)桿菌滲透注射后第七天觀察,重組病毒載體

4、侵染的煙草系統(tǒng)葉有病毒侵染癥狀,而對照組未有此現(xiàn)象。對兩組實驗進行逐日跟蹤觀察,重組病毒載體侵染的煙草有較嚴重的病毒侵染癥狀和葉片卷曲現(xiàn)象,后期還會引起注射葉及系統(tǒng)葉的壞死。而空病毒載體侵染的煙草只有輕微的病毒侵染癥狀,并能夠恢復健康。對侵染的煙草作RT-PCR檢測,結果表明外源基因BYDV-MP在煙草體內進行了正常的轉錄和表達。由此我們得出結論:(1)BYDV-MP蛋白促進了 PVX的系統(tǒng)侵染速度,加重了系統(tǒng)侵染的病毒癥狀,是病毒病癥

5、的決定因子;(2)由于BYDV-MP侵染導致煙草葉片卷曲、形態(tài)異常及生長抑制等現(xiàn)象,表明BYDV-MP影響了被侵染植株的正常發(fā)育,但是其作用的分子機制還有待進一步的實驗驗證;(3)此外,還驗證了利用PVX表達載體表達異源MP的方法是可行的。
　　本研究建立了馬鈴薯X病毒表達外源蛋白的技術體系,在野生煙草中表達了大麥黃矮病毒的運動蛋白基因,這為進一步研究BYDV的MP蛋白功能奠定了基礎,同時也對應用BYDV-MP蛋白基因介導的抗病毒