小麥萌發(fā)種子胚乳和鹽脅迫根尖中內(nèi)肽酶及20S蛋白酶體的研究.pdf

1、以小麥栽培品種揚麥158(Triticum aestivum L.， Yangmai158)為實驗材料，研究了小麥種子吸脹及后續(xù)幼苗生長過程中胚乳中內(nèi)肽酶（endopeptidases, EPs）的變化和生化特性，以及胚乳中20S蛋白酶體的生化特性和其對種子萌發(fā)過程的響應(yīng)；并研究了鹽脅迫下小麥幼苗根尖的氧化傷害對20S蛋白酶體的影響。主要研究結(jié)果如下：1.小麥種子吸脹后胚乳中半胱氨酸內(nèi)肽酶和20S蛋白酶體的研究
　　 采用與明膠

2、共聚4-20％梯度凝膠電泳的方法研究了小麥種子吸脹后胚乳中內(nèi)肽酶的變化及其生化特性。在小麥種子吸脹0-7 d內(nèi)，小麥胚乳內(nèi)有4種半胱氨酸內(nèi)肽酶(EP1， EP2， EP3和EP4)逐漸出現(xiàn)，且它們的活性都隨著實驗時間的延長而逐漸增加；在這些EPs中，EP2不僅最先出現(xiàn)，而且它的活性在整個實驗過程中也一直是最高的。這4種EPs的最適pH都是4.0，最適溫度都是40℃，它們的活性都能被25μME-64完全抑制，因此，這4種EPs都屬于半胱氨

3、酸內(nèi)肽酶。4種EPs對熱都不很穩(wěn)定，特別是EP1的熱穩(wěn)定性最差。此外，這4種EPs對成熟小麥籽粒貯藏蛋白質(zhì)，清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白和麥谷蛋白有不同的底物專一性。在4種EPs中，EP2對球蛋白，醇溶蛋白和麥谷蛋白均有最高的蛋白水解活性。綜合以上結(jié)果，我們認為EP2可能是與小麥種子萌發(fā)及其幼苗生長相關(guān)最緊密且最重要的一種內(nèi)肽酶。
　　 首先采用連續(xù)3次離心和梯度PAGE(GPAGE)后切膠回收的方法純化小麥胚乳中的20S蛋白酶體，

4、通過GPAGE及Western印跡檢測證明獲得了純的20S蛋白酶體，然后對20S蛋白酶體和其在小麥種子萌發(fā)及幼苗生長過程中的生化特性進行了研究。結(jié)果表明，提純的20S蛋白酶體能明顯地切割模式合成底物Z-GGL-AMC和Z-GGR-AMC的芳－肽鍵，表示該20S蛋白酶體具有胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性，這兩種蛋白酶活性的最適pH都為8.0，而其胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性的最適溫度分別為55℃和37℃，但這兩種蛋白酶活性都能被MG115和P

5、MSF顯著性地抑制。以上結(jié)果表明，我們提純的蛋白酶是一種典型的20S蛋白酶體。結(jié)果同時還表明，在小麥種子吸脹0-7 d內(nèi)，胚乳內(nèi)多聚泛素化蛋白的含量保持不變.但是與糊粉層相關(guān)的20S蛋白酶體的酪蛋白水解活性和蛋白含量在1-2d內(nèi)逐漸降低，但在2-4 d期間逐漸增加，在4d達到最高水平，并保持最高水平一直到7d。在2-4 d期間，20S蛋白酶體的β5-亞基mRNA水平增加到較高的水平，20S蛋白酶體的酪蛋白水解活性和蛋白含量相應(yīng)地從3d開

6、始逐漸增加。此外，小麥胚乳的主要貯藏蛋白不能被20S蛋白酶體降解。以上結(jié)果進一步表明，在小麥種子吸脹后的這段時間內(nèi)，胚乳中20S蛋白酶體的主要作用可能不是用來降解胚乳中大量貯藏蛋白的。
　　 2.鹽脅迫下小麥根尖的氧化傷害對20S蛋白酶體的影響
　　 為研究鹽脅迫下小麥根尖的氧化傷害對20S蛋白酶體的影響，用200 mM NaCl脅迫小麥幼苗12、24、48和72 h，之后分別取其根尖。測定了其中H2O2含量、O2-產(chǎn)生

7、的速率、膜脂過氧化程度和質(zhì)膜完整性；及20S蛋白酶體的羰基化水平、酪蛋白水解活性及蛋白含量變化等生化特性。同時也測定了小麥根尖細胞內(nèi)羰基化蛋白和泛素化蛋白的含量。結(jié)果表明，小麥根尖中H2O2含量、O2－產(chǎn)生的速率、TBARS含量和細胞死亡數(shù)都隨著脅迫時間的延長而逐漸增加。對根尖進行組織染色發(fā)現(xiàn)，膜脂過氧化和質(zhì)膜完整性破壞的程度和分布范圍隨著脅迫時間的延長而逐漸加重和擴大。在72 h鹽脅迫過程中，小麥根尖中總酪蛋白水解活性和20S蛋白酶體