Ⅰ型干擾素受體在雞消化道各器官的載量與分析.pdf

1、干擾素(interferon，IFN)是由生物體細胞受到病毒或其它誘生劑的作用而產生的分泌性糖蛋白，具有廣泛生物學活性，如抗病毒、抗細胞增殖、免疫調節(jié)等多種生物學活，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。干擾素按其與受體結合的原則，分為Ⅰ型和Ⅱ型，后來發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素按其與抗體結合的抗原性不同又可分為兩類，故把Ⅰ型干擾素又分為α、β兩大類，將原來的Ⅱ型干擾素命名為γ。IFN-α和IFN-β的分子有序列同源性，共用相同的細胞表面受體——Ⅰ型干擾素受

2、體(IFNAR)，IFN-γ是一種同源二聚體糖蛋白，其細胞表面受體為Ⅱ型干擾素受體(IFNGR)。Ⅰ型干擾素受體由兩條鏈組成，α鏈（IFNAR-1）和β鏈(IFNAR-2)，IFNAR-1的生物學功能與干擾素結合以及生物信號傳導有關，而IFNAR-2的生物學功能尚未清楚。
　　IFNAR-1是IFNAR的一個重要亞單位蛋白，在干擾素與干擾素受體結合的過程中發(fā)揮著重要的作用，因此，研究IFNAR-1在雞消化道各器官的分布對分析干擾素

3、在消化道作用及吸收的部位有重要的意義。本實驗從兩方面來檢測IFNAR-1在消化道各器官的分布:一是基因層面，二是蛋白層面。采用實時熒光定量PCR檢測;哺乳動物細胞表達，將檢測基因IFN-β和報告基因GFP融合一體，這樣就可以減少非特異性吸附的問題，提高了檢測方法的特異性。此外，采用哺乳動物真核表達方式，可以保留蛋白的天然結構和蛋白的生物活性。
　　為了進一步研究和探尋IFNAR在消化道各器官的分布，采用反轉錄-聚合酶鏈式反應RT-

4、PCR的方法從雞脾臟中提取擴增了IFNAR-1基因，克隆到PMD-18 T載體中構建成實時熒光定量PCR的標準質粒，并選取β-actin基因作為內參基因，做出各自的標準曲線。然后，采集實驗組和對照組雞的上顎、舌、食管、嗉囊、腺胃、十二指腸、直腸等器官，提取mRNA，反轉錄成cDNA，對采集的樣品進行實時熒光定量PCR檢測。檢測結果發(fā)現(xiàn)，IFNAR-1基因在以上各器官多少都有分布，但食管和舌部位最多。
　　我們將IFN-β基因與pE

5、GFP-N1鏈接構建成pEGFP-N1-IFN-β重組質粒，然后將IFN-β基因和GFP基因融合后擴增，最后將克隆得到的基因IFN-β+GFP與真核表達載體pcDNA3.1/V5-HisA鏈接。將重組后的質粒pcDNA3.1-N1-IFN-β+GFP轉染到HEK-293T細胞中，48h后可以通過熒光顯微鏡看融合蛋白表達的情況。表達成功后，融合蛋白采用鎳柱進行純化，再經過免疫印跡(Western-Blot)檢測融合蛋白的純化情況。將實驗組

6、和對照組雞上顎、舌、食管、嗉囊、腺胃、十二指腸、直腸等器官制成冰凍切片，用純化的融合蛋白浸潤切片，在熒光顯微鏡下檢測切片熒光強度。結果發(fā)現(xiàn)除了舌和食管能夠檢測到微弱的熒光，其余器官均檢測不到熒光。
　　此外，我們分別對口服干擾素的實驗組雞和口服等量生理鹽水的對照組雞攻等量的新城疫病毒，發(fā)現(xiàn)實驗組雞死亡率遠遠小于對照組。綜合以上實驗，我們可以得出干擾素受體(IFNAR)基因主要集中在舌和食管部位，即干擾素的作用部位在舌和食管;同時，