黃瓜葉片衰老過(guò)程中內(nèi)肽酶變化及其生化特性的研究.pdf

1、葉片衰老是葉片生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一個(gè)重要階段，該期間蛋白質(zhì)的降解是葉片衰老過(guò)程中一個(gè)極其重要的事件，蛋白質(zhì)降解后的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)運(yùn)送到生長(zhǎng)旺盛的組織或貯藏器官被再利用對(duì)后者的生長(zhǎng)具有重要意義；另一方面葉片蛋白質(zhì)，尤其Rubisco的降解影響光合作用的進(jìn)行，對(duì)生物產(chǎn)量的形成和提高造成不良影響。因此研究和弄清葉片蛋白質(zhì)降解機(jī)制具有重要的意義。許多研究認(rèn)為內(nèi)肽酶在葉片蛋白質(zhì)降解中起主要作用，但不同植物中內(nèi)肽酶種類、特性等存在差異，因此深入研究不同植物

2、中內(nèi)肽酶變化規(guī)律及其功能對(duì)揭示蛋白質(zhì)降解機(jī)制有重要作用。黃瓜是我國(guó)栽培面積較大的蔬菜作物，由于黃瓜為無(wú)限生長(zhǎng)植物，在生產(chǎn)中葉片早衰是影響黃瓜產(chǎn)量的重要因素，因此，延緩黃瓜葉片衰老無(wú)疑將顯著增加其產(chǎn)量。但國(guó)內(nèi)對(duì)黃瓜葉片衰老的研究主要集中在光合特性變化和栽培措施等方面，對(duì)其衰老機(jī)制尤其是葉片蛋白質(zhì)降解與內(nèi)肽酶的關(guān)系研究則幾乎未見(jiàn)報(bào)道。本文研究了黃瓜葉片衰老過(guò)程中的主要生理生化特性變化，并重點(diǎn)對(duì)葉片蛋白質(zhì)降解及其內(nèi)肽酶同工酶變化及其生化特性等

3、進(jìn)行了研究，結(jié)果表明： 黃瓜葉片衰老過(guò)程中，葉片的葉綠素含量、凈光合速率、蛋白質(zhì)含量和SOD活性降低，但MDA含量和POD活性增加；葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，外形由長(zhǎng)橢圓形逐漸趨于圓形；葉綠體內(nèi)淀粉粒由多而大逐漸變少而小，油脂則由小而少變大而多；基粒片層由細(xì)長(zhǎng)沿葉綠體長(zhǎng)軸方向排列，逐漸變粗短，排列雜亂至模糊不清，內(nèi)含物向細(xì)胞中擴(kuò)散而最終導(dǎo)致葉綠體解體。因此葉片蛋白質(zhì)的降解可能與葉綠體結(jié)構(gòu)的變化和葉片內(nèi)的氧化脅迫增加有關(guān)。

4、為研究黃瓜葉片衰老過(guò)程中內(nèi)肽酶變化對(duì)可溶性蛋白質(zhì)降解的影響，采用以明膠為底物的梯度凝膠電泳活性染色方法，首次對(duì)自然衰老過(guò)程中黃瓜葉片內(nèi)肽酶同工酶的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，黃瓜葉片自然衰老過(guò)程中蛋白質(zhì)含量在葉片伸出后15天左右最高，隨后開(kāi)始降低；內(nèi)肽酶活性在葉片伸出35d后顯著升高，此時(shí)葉片中蛋白質(zhì)明顯發(fā)生降解。黃瓜葉片內(nèi)肽酶的最適pH為7.0，最適溫度為40℃，內(nèi)肽酶活性可被Ca<'2+>、半胱氨酸等激活，內(nèi)肽酶抑制劑分析顯示絲氨酸類

5、型的內(nèi)肽酶活性占總活性的57％左右。梯度凝膠電泳活性染色方法檢測(cè)到至少4種黃瓜葉片內(nèi)肽酶同工酶，各同工酶活性變化和出現(xiàn)時(shí)期在自然衰老過(guò)程中不同；絲氨酸內(nèi)肽酶同工酶2，3隨葉片衰老活性增強(qiáng)，為黃瓜葉片中主要的內(nèi)肽酶同工酶。為進(jìn)一步了解黃瓜葉片衰老期間的各種內(nèi)肽酶同工酶變化及其生化特性，采用離體葉片暗誘導(dǎo)處理進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，暗誘導(dǎo)使葉片衰老加速，葉綠素含量快速下降，葉片蛋白質(zhì)降解與內(nèi)肽酶活力升高呈負(fù)相關(guān)。應(yīng)用活性電泳方法檢測(cè)到了黃瓜葉片

6、暗誘導(dǎo)衰老過(guò)程中有9種內(nèi)肽酶同工酶(CEP1-9)，其中6種(CEP1， 5，6，7，8，9)與衰老進(jìn)程相關(guān)。而且，黃瓜葉片在自然衰老中出現(xiàn)的同工酶，在暗誘導(dǎo)衰老中也出現(xiàn)。對(duì)內(nèi)肽酶同工酶生化特性研究表明，各種同工酶在40℃時(shí)活性最高，適宜的pH為6.0-8.0；其中CEP3熱穩(wěn)定性最高。所檢測(cè)到的內(nèi)肽酶同工酶中，CEP2，3，4，9內(nèi)肽酶活性較強(qiáng)，為黃瓜葉片衰老中主要的內(nèi)肽酶，它們?cè)趐H5.0-9.0的范圍內(nèi)均有活性，最適pH為7.0；

7、溫度低于25℃或高于60℃各內(nèi)肽酶均沒(méi)有活性。蛋白酶抑制劑試驗(yàn)分析表明，CEP2，3，4，9屬于絲氨酸型內(nèi)肽酶，CEP6為半胱氨酸型內(nèi)肽酶，因此認(rèn)為絲氨酸型內(nèi)肽酶在黃瓜葉片衰老中具有重要作用。 為深入了解黃瓜衰老葉片中活性最強(qiáng)的絲氨酸內(nèi)肽酶的生理作用，采用絲氨酸內(nèi)肽酶抑制劑AEBSF、ABA和GA處理的方法，研究了其對(duì)黃瓜葉片衰老的影響，結(jié)果表明，50μM 6-BA與絲氨酸內(nèi)肽酶抑制劑AEBSF處理不僅能抑制葉片內(nèi)肽酶活性的升高

8、、延緩葉片蛋白質(zhì)降解，而且能提高SOD活性，降低POD活性；而50 μM ABA則促進(jìn)了內(nèi)肽酶活性的升高；但50μ MABA+10mmol/L AEBSF處理后葉片內(nèi)肽酶活性低于單獨(dú)ABA處理?；钚噪娪撅@示，黃瓜葉片中檢測(cè)到6條內(nèi)肽酶同工酶，其中4條(CEP2，3，4，6)為絲氨酸型內(nèi)肽酶，內(nèi)肽酶抑制劑AEBSF抑制了葉片中絲氨酸內(nèi)肽酶同工酶的活性，而ABA使絲氨酸內(nèi)肽酶CEP2，3，4的活性顯著增強(qiáng)，再次暗示了絲氨酸型內(nèi)肽酶在黃瓜葉片

9、衰老以及葉片Rubisco降解中具有重要作用，而且除了絲氨酸內(nèi)肽酶外，可能還有其它因素參與了衰老的調(diào)控。 還應(yīng)用外源氮肥處理，研究了其對(duì)黃瓜葉片中蛋白質(zhì)降解與內(nèi)肽酶活性及同工酶變化的影響，以期了解N素對(duì)植物內(nèi)肽酶表達(dá)和活性表現(xiàn)的影響。結(jié)果表明，隨著葉面施氮濃度的提高，葉片蛋白質(zhì)含量增加、而內(nèi)肽酶活性減弱，在一定N濃度范圍內(nèi)，葉片生長(zhǎng)正常，葉片沒(méi)有衰老癥狀。高氮處理間內(nèi)肽酶同工酶組成上變化不明顯，但在低氮處理中，內(nèi)肽酶同工酶活性增