小麥WHSP90基因特性分析與W17基因啟動(dòng)子功能鑒定.pdf

1、植物在逆境條件下能識(shí)別各種脅迫信號(hào)、激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而表現(xiàn)出抗逆性。植物HSP90和ERF類轉(zhuǎn)錄因子在植物生物和非生物脅迫信號(hào)的傳遞、抗逆相關(guān)基因的調(diào)控及提高作物的抗逆性起著極其重要的作用。本試驗(yàn)對(duì)小麥熱激蛋白HSP90基因特性以及ERF類轉(zhuǎn)錄因子W17基因啟動(dòng)子的功能進(jìn)行分析鑒定，為深入了解植物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆基因的表達(dá)調(diào)控和小麥抗逆基因工程研究提供理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.W

2、HSP90基因的表達(dá)特性分析結(jié)果表明：WHSP90基因受高溫、干旱、鹽、低溫、乙烯（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）和水楊酸（SA）的誘導(dǎo)，但對(duì)各種脅迫響應(yīng)的時(shí)間和強(qiáng)度不同，其中，對(duì)ET、高溫和干旱響應(yīng)比較強(qiáng)烈。說明WHSP90可能參與多種信號(hào)途徑，但在各種脅迫信號(hào)途徑中發(fā)揮不同的作用。 2.WHSP90的亞細(xì)胞定位分析顯示：構(gòu)建WHSP90的亞細(xì)胞定位重組載體，基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)24h后共聚焦顯微

3、鏡下觀察，確定WHSP90蛋白的定位。結(jié)果表明，WHSP90—GFP融合蛋白激發(fā)的熒光在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，說明WHSP90在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核里行使功能。 3.WHSP90的原核表達(dá)及抗體制備：構(gòu)建原核表達(dá)載體His—WHSP90和GST—WHSP90，進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)：純化蛋白His—WHSP90，免疫家兔制備多克隆抗體，免疫后兔抗血清效價(jià)大于125000，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求的效價(jià)值。 4.WHSP90基因轉(zhuǎn)化擬南芥：構(gòu)

4、建雙子葉轉(zhuǎn)基因載體，電擊轉(zhuǎn)化法將WHSP90基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58C1，真空滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥，收集轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株的種子（T0代），在Kana—MS培養(yǎng)基上篩選，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥8株。 5.W17基因啟動(dòng)子功能鑒定：通過Ⅰ—PCR延伸W17基因啟動(dòng)子片段，獲得啟動(dòng)子1859 bp。構(gòu)建W17基因啟動(dòng)子缺失載體，轉(zhuǎn)化小麥成熟胚愈傷組織，并進(jìn)行化學(xué)染色分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過旱（PEG6000）、脫落酸（ABA）、鹽（NaCl）、水楊酸（S