上海地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒流行株檢測分析及siRNA的干擾效應.pdf

1、原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明:所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內容外，本論文不包含任何其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結果由本人承擔。學位論文作者(需親筆，簽“:鈞tj，堆朔少日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解學校有關保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留并向國家有關部門或機

2、構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權南京農業(yè)大學可以將本學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存和匯編本學位論文。保密口，在_年解密后適用本授權書。本學位論文屬于不保密口。(請在以上方框內打“V學位論文儲(需親筆’簽“:甸鄒導師‘需”’簽“’以xAvor年4月)日、公年華月冷日is海地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒流行株檢測分析及SiRNA的千擾效應采用MBGA軟件分析所有分離

3、株S2片段同源性，可以看出上海地區(qū)流行株S2片段同源性非常高(”%)，表明至少在一定時期(2002年一2003年)內，流行毒株的變異率不高，這為研制和使用相應的疫苗提供了可能.從GenBank中下載相應IBVS2基因片段，比較發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)分離株與其他地區(qū)賢變型IBV有較高同源性(=91%)與參考呼吸型毒株間差異較大(=88%同源性)，上海地區(qū)流行毒株與一株山東青島膝可型分離毒〔SD9702)同源性較高，但與浙江腺胃型分離毒株ZJ971分

4、子差異較大.國內分離株ZJ971與我國使用的疫苗株H52均處于北美流行群中，且二者同源性很高，ZJ971S基因可能來源于疫苗株H52.除一株北京地區(qū)分離株分子特征較為特殊外，我國分離株均處于一個分支內，表現(xiàn)出一定的區(qū)域特性。以我國近年來報道的不同組織嗜性IBVS基因作為分析參考序列(除SD9702毒株未見相關S1序列外)，發(fā)現(xiàn)，無論利用SI全基因還是S1基因片段進化分析均顯示:浙江腺胃型分離株ZJ971與呼吸型參考株H52為親源關系較近

5、的一支而國內呀變型分離株LH20110和LX4組成進化中的另一分支。表明S1基因片段同S1一樣，能反映IBV的進化規(guī)律和親緣關系。盡管IBVS2片段間變異率明顯低于SI，二者在毒株間表現(xiàn)出相同的進化趨勢及親緣關系，S2片段可用于IBV分子變異規(guī)律分析.2SiRNA對細胞培養(yǎng)IBV的RNA干擾作用研究比較已發(fā)表的IBV基因組序列，設計了針對IBV各基因組片段的SiRNA1280個，通過同源性比較和保守性分析，篩選符合條件的SiRNA12個

6、，分別針對PolMN基因。在IBV接種到Ver。細胞前68h、接種后2h，利用化學方法轉染SiRNA培養(yǎng)12h后，在轉染N1221Po150siRNA細胞內，觀察到IBV病毒粒子明顯少于對照接種細胞，表明IBV增殖受到抑制。提取正常Ver。細胞、IRV接種細胞、轉染siRNA病毒接種細胞的總RNA，采用建立的多聯(lián)RTPCR方法，以細胞持家基因口actin做內參，檢測mRNAN基因豐度，再利用非變性蛋白凝膠電泳，Westernblot檢測

7、IBV蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)轉染siRNA后，IBVmRNA及合成的蛋白下降，顯著低于IBV細胞接種組，表明siRNAPo150N1221抑制了IBV在Vero細胞上的增殖。分別對N1221的正、負鏈進行修飾(每個核普酸2OH被0CH3取代)，形成的雙鏈RNA中被修飾的一條鏈不能與相應的靶mRNA作用，從而失去RNA干擾作用.轉染修飾后siRNA的細胞與轉染野生型siRNA的細胞，經(jīng)IBV熒光杭體染色發(fā)現(xiàn)，負鏈被修飾的siRN人轉染細胞與野