養(yǎng)雞場舍環(huán)境攜帶耐藥基因的金黃色葡萄球菌的氣溶膠形成及傳播研究.pdf

1、人們對養(yǎng)雞場的養(yǎng)殖環(huán)境中金黃色葡萄球菌氣溶膠的發(fā)生及其傳播已經(jīng)有了較全面的認(rèn)識，但是對氣載金葡菌的耐藥性及其攜帶耐藥基因的傳播的理解還比較膚淺。因此，該研究對當(dāng)前養(yǎng)雞場環(huán)境中金黃色葡萄球菌的耐藥現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)查，以及其耐藥基因予以鑒定，揭示養(yǎng)雞場具有耐藥性及攜帶耐藥基因的環(huán)境金黃色葡萄球菌氣溶膠的發(fā)生及傳播機(jī)制，闡明養(yǎng)雞場的用藥善包括濫用藥物情形，給養(yǎng)雞場的疾病預(yù)防和臨床用藥方面作出一定的指導(dǎo)，具有流行病學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)共分為以下四

2、個部分：
　　 第一部分，養(yǎng)雞場樣品的采集與金黃色葡萄球菌分離鑒定
　　 本研究采用ANDERSEN-6空氣樣品采樣器對泰安周邊地區(qū)的六個養(yǎng)雞場的雞只糞便、泄殖腔棉拭子、雞舍內(nèi)、外環(huán)境空氣樣品進(jìn)行采樣，其中采樣介質(zhì)為Baird-parker培養(yǎng)基。將從每個雞舍中采集到的糞便與棉拭子樣品經(jīng)倍比稀釋后接種到高鹽甘露醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取橘黃色的菌落接種到Baird-parker瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后將所有樣品中可疑菌落放在金黃

3、色葡萄球菌的顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取藍(lán)色菌落，依據(jù)耐熱核酸酶基因(nuc)的引物用試劑盒提取其基因組DNA跑PCR的方法分離鑒定得到149株金黃色葡萄球菌。
　　 第二部分，金黃色葡萄球菌的藥物敏感試驗(yàn)及其耐藥性的氣源性傳播
　　 本研究采用不同種類的15種抗生素并用K-B紙片擴(kuò)散法對這149株菌進(jìn)行耐藥性調(diào)查，結(jié)果顯示，從六個雞場上述樣品中中分離的金葡菌5.37％(8/149)的菌株對甲氧西林類藥物耐藥即為MRSA(met

4、hicillin-resistantStaphylococcusaureus)，94％(140/149)的菌株對復(fù)方新諾明耐藥，78.5％(117/149)的菌株對青霉素耐藥，66.4％的菌株對(99/149)紅霉素耐藥，75.2％(112/149)的菌株對四環(huán)素耐藥，對其它藥物也存在不同程度的耐藥；但是對萬古霉素完全敏感。此外，這些金葡菌菌株還呈現(xiàn)多重耐藥，4～6重耐藥的菌株居多，分別達(dá)到16.1％(24/149)，32.9％(49/

5、149)，14.8％(22/149)，9重耐藥菌有3株。尤其值得注意的是，從養(yǎng)雞場雞糞便、舍內(nèi)、外環(huán)境即上風(fēng)10、50m，下風(fēng)10、50、100、200m空氣分離的部分菌株其耐藥性基本一致，其說明其耐藥性有可能存在由糞便、棉拭子或舍內(nèi)空氣傳播到舍外上風(fēng)或下風(fēng)的情況。
　　 第三部分，金黃色葡萄球菌REP-PCR的溯源性鑒定
　　 本實(shí)驗(yàn)采用DNA基因外重復(fù)一致回文序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(REP-PCR)鑒定技術(shù)，然后根據(jù)文獻(xiàn)

6、中公布的通用引物對每個雞場雞舍內(nèi)空氣、舍外環(huán)境不同距離分離到的金黃色葡萄球菌，連同糞便、棉拭子中分離到金黃色葡萄球菌進(jìn)行REP-PCR溯源鑒定，分析其遺傳相似性或同源性。
　　 在6個養(yǎng)雞場中，從舍外下風(fēng)方向分離到的多數(shù)金黃色葡萄球菌(55.9％)與舍內(nèi)空氣或糞便中分離的金黃色葡萄球菌遺傳相似性(Similarity)可達(dá)100％?？梢?，它們分別是由糞便中遺傳基因完全相同的菌株繁殖和傳播而來。而從舍外上風(fēng)分離到的金黃色葡萄球菌與

7、舍內(nèi)空氣或糞便中分離的金黃色葡萄球菌相似性僅在47.3％-72.2％之間，說明這些金葡菌為其它來源，與養(yǎng)殖場沒關(guān)系。結(jié)果顯示，糞便中的金黃色葡萄球菌能夠形成氣溶膠，進(jìn)入氣懸狀態(tài)，不僅能在舍內(nèi)傳播，而且能夠借助舍內(nèi)外氣體交換，傳播到舍外下風(fēng)一定的距離。不僅對本舍畜群構(gòu)成傳染威脅，而且，病原菌能傳播到一定的距離，對周邊社區(qū)環(huán)境空氣造成生物污染。
　　 第四部分，攜帶不同耐藥基因的金黃色葡萄球菌的檢測及氣源性傳播
　　 6個養(yǎng)

8、雞場149株S.aureustetM基因的檢出率在32.0％至92.7％之間，mecA基因只有A場與B場檢出，檢出率分別為4.2％、8.3％。而ermC基因與其對應(yīng)的耐藥表型的檢出率分別為83.3％/100％、95.8％/91.7％、39.3％/53.6％、38.9％/44.4％、40％/28％、63.3％/76.7％；aac(6’)-aph(2”)基因與其對就的耐藥表型的檢出率為62.5％/66.7％、20.8％/8.3％、10.7％

9、/10.7％、11.1％/0％、20％/38.5％、16.7％/16.7％；在6個雞場的149株金葡菌中mecA、tetM、ermC、aac(6’)-aph(2”)基因與其所對應(yīng)的耐藥表型的總檢出率也存在差別分別是2％/5.4％、63.1％/75.2％、60.4％/66.4％、23.5％/20.8％。
　　 選擇基因溯源鑒定同源性為100％的菌株進(jìn)行耐藥基因(tetM、mecA、ermC、ermA、aac(6’)-aph(2”)