藥學畢業(yè)論文蜈蚣藻中多酚的提取及抗氧化研究

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p>　　蜈蚣藻中多酚的提取及抗氧化研究</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 藥學

2、 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b>&

3、lt;/p><p><b>　　中文摘要3</b></p><p><b>　　英文摘要4</b></p><p><b>　　1 前言5</b></p><p>　　2 實驗材料、主要儀器與試劑6</p><p>　　2.1 材料與試劑6<

4、/p><p>　　2.2 主要儀器6</p><p><b>　　3 實驗方法7</b></p><p>　　3.1 紅蜈蚣藻多酚的提取7</p><p>　　3.2 紅蜈蚣藻多酚含量的測定7</p><p>　　3.3 紅蜈蚣藻多酚抗氧化活性的測定7</p><p>

5、;　　3.3.1 清除DPPH 自由基能力的測定(DPPH法) 7</p><p>　　3.3.2 清除羥自由基能力的測定8</p><p>　　3.3.3 鐵還原力能力的測定8</p><p>　　4 實驗結果與討論8</p><p>　　4.1紅蜈蚣藻多酚含量8</p><p>　　4.2 紅蜈蚣藻多酚的

6、抗氧化活性9</p><p>　　4.2.1 清除DPPH自由基能力的測定9</p><p>　　4.2.2 清除羥自由基能力的測定9</p><p>　　4.2.3 鐵還原力能力的測定10</p><p><b>　　4.3 討論10</b></p><p><b>　　5

7、結論11</b></p><p><b>　　參考文獻11</b></p><p><b>　　致 謝13</b></p><p>　　蜈蚣藻中多酚的提取及其抗氧化研究</p><p>　　[摘要]目的：研究蜈蚣藻中多酚的體外抗氧化能力。方法：采用工業(yè)甲醇浸泡提取，依次用石油醚、乙

8、酸乙酯、正丁醇萃取蜈蚣藻多酚，分別利用三種體系，通過對二苯基苦味肼基自由基(DPPH·)、羥自由基(·OH)和鐵還原力能力來評價其抗氧化活性。采用Folin–Ciocalteau試劑測定總多酚含量。結果：蜈蚣藻多酚對DPPH的清除率隨著多酚濃度的增加清除能力增強：石油醚相>乙酸乙酯相>正丁醇相>粗提物；對羥自由基的清除率：石油醚相>粗提物>乙酸乙酯相>正丁醇相；Fe還原力的大?。菏?/p>

9、油醚相>乙酸乙酯相>正丁醇相>粗提物，即石油醚相抗氧化活性最好。當5 mg/ml濃度時，粗提物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相萃取物對DPPH·的清除率分別為50.51%、83.58%、64.82%、55.70%，對·OH的清除率分別75.95%、93.99%、51.86%、30.94%，且其鐵還原力測定為0.1425、0.6204、0.3497、0.1725，且總酚含量與蜈蚣藻各提取物的抗氧化活性

10、之間具有一定的相關性。結論：蜈蚣藻的石油醚相在清除羥自由基和DPPH自由基方面表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。這些數據表明:甲醇提</p><p>　　[關鍵詞] 多酚；抗氧化活性；DPPH；OH；Fe還原力</p><p>　　Evaluation of Antioxidant Activity of Polyphenol Obtained from Grateloupia filicina&l

11、t;/p><p>　　[Abstract] Objective: To investigate the antioxidation capacity of the polyphenol in vitro extracted from Grateloupia filicina. Methods: The antioxidant activities of methanol (MC) extracts and fract

12、ions （petroleum ether、ethyl acetate、n-butyl alcohol and water fraction） from Grateloupia filicina were evaluated through DPPH/hydroxyl radical-scavenging activity and reducing power. Total phenolic content was investigat

13、ed using Folin–Ciocalteau reagent. Result: DPPH radical-scavenging activity of po</p><p>　　Antioxidant activities of crude extract and fractions showed an increase with increasing concentration indicating th

14、e dose dependency of these properties. Conclusion: Polyphenol of Grateloupia filicina had strong antioxidation activity, which can scaveng DPPH and hydroxyl free radical. These data suggest that the methanolic extracts a

15、nd fractions may be useful as antioxidant supplements due to its high phenolic content.</p><p>　　[Key words] Grateloupia filicina; Polyphenol; Anitioxidation activity</p><p><b>　　1 前言</

16、b></p><p><b>　　1.1 蜈蚣藻</b></p><p>　　海藻生活在特殊生態(tài)環(huán)境（高鹽度，高壓，低氧，避光）下，普遍含有特殊功能的生物活性物質如酚類、吲哚類、萜類等化合物，是海洋天然藥物的重要來源。蜈蚣藻屬于紅藻門、真紅藻綱、隱絲藻目、海膜科、蜈蚣藻屬[1]。藻體紫紅色，粘滑，叢生，線形或略扁壓，單一及頂，主干明顯，規(guī)則或不規(guī)則的羽狀分枝，生

17、長在低潮帶附近巖石和貽貝養(yǎng)殖架上。蜈蚣藻為世界性的暖溫帶型海藻，產于我國南北各地，在我國的青島、大連等沿海地區(qū)有著廣泛的分布。多可食用或作制膠原料，廣東潮陽等地居民常用作驅蛔蟲藥[2]。中國蜈蚣藻屬共報道32種[3]。該屬海藻種類的外部形態(tài)各種各樣，變異很大，如帶形蜈蚣藻為黏滑的葉片狀，而繁枝蜈蚣藻為硬的革質的線形，同一種類的形態(tài)也因生態(tài)環(huán)境、地域的不同變化很大[4]。</p><p><b>　　1.

18、2 多酚</b></p><p>　　多酚是植物的莖、葉、花等部分所含有的色素、苦味和澀味成分的總稱。它是通過光合作用合成的，種類多，其中還有一部分不為人所了解。雖然多酚類物質不是人體每日所必需的營養(yǎng)素，但現(xiàn)在的醫(yī)學研究中發(fā)現(xiàn)這類物質卻具有超強的抗氧化能力。其主要包括類黃酮化合物和酚酸類化合物，具有很強的消除有害自由基能力，抗衰老、抗輻射、抗菌、殺菌作用，以及對癌細胞和艾滋病病毒的抑制作用[5]。多酚

19、作為一種強抗氧化劑、自由基清除劑，可以使機體內源性的抗氧化酶活性增加，或通過膳食補充外源抗氧化劑起到預防腫瘤等疾病發(fā)生的作用。但它的抗氧化機制比較復雜，一般認為：清除自由基、酚羥基的離解，絡合有催化作用的金屬離子，吸收紫外光是起主要作用的因素。</p><p><b>　　1.3 自由基</b></p><p>　　生物機體內絕大多數分子是由氫離子和其它基團組成的,

20、常?？梢园l(fā)生其它基團與氫離子的解離, 形成帶一個電子的其它基團與氫離子, 稱為氧自由基。常見的有: 氧離子自由基、羥自由基、脂質自由基、過氧化氫自由基、氫自由基、有機自由基、烷氧基自由基、有機過氧自由基、氧化脂質自由基等。自由基極其不穩(wěn)定, 容易與其它物質反應生成新的自由基, 因而往往產生連鎖反應。自由基連鎖反應一開始, 所生成的新自由基就進一步與基質反應, 從而導致基質的大量消耗, 及多種自由基產物的生成。機體新陳代謝產生自由基, 可

21、以造成機體的損傷, 致使疾病的發(fā)生。正常情況下, 機體有完善的自由基清除系統(tǒng), 控制著自由基的產生與清除。隨著機體的老化, 自由基清除系統(tǒng)逐漸功能減弱, 造成自由基大量聚集, 最終造成不可逆轉的損傷, 生命從而走向凋亡。隨著年齡增長, 機體內自由基水平呈增長趨勢, 同時自由基清除機制卻逐步退化, 結果造成體內自由基大量積聚。所以自由基對機體的健康危害日益加重, 引發(fā)了多種生理功能的障礙, 促進多種老年疾病的發(fā)生發(fā)展,導致機體的衰老, 直

22、至死亡。在整個衰老過程中, 自由基引起大量細胞衰老、死亡, 近年來有</p><p><b>　　1.4 抗氧化劑</b></p><p>　　抗氧化劑是一類能幫助捕獲且中和自由基，從而去除自由基對人體損害的一類物質，不僅可以能防止油脂和食品氧化延長保質期，且還有許多防病保健功能[7]。因此，抗氧化劑廣泛用于食品工業(yè)，需求量逐年不斷增加。由于合成抗氧化劑像植物酸（BH

23、A）、2，6- 二叔丁基對甲酚（BHT）和特丁基對苯二酚（TBHQ）等其的毒性問題[8]，以及人們越來越追求綠色環(huán)保消費，故開發(fā)安全、高效的天然抗氧化劑已成為食品工業(yè)的一項重大課題。海藻是人類在食品、工業(yè)、藥用等方面的重要資源[9]。近年來，海藻中次生代謝物質，如萜類、甾醇類、大環(huán)內酯類和酚類等已成為研究的熱點，特別是多酚物質因其所具有的抗氧化特性而備受矚目[10-12]。</p><p>　　因此，本論文以蜈蚣

24、藻多酚為研究對象，對其提取工藝和抗氧化活性進行評價，為其后續(xù)開發(fā)提供參考依據。</p><p>　　2 實驗材料、試劑與主要儀器</p><p><b>　　2.1 材料與試劑</b></p><p>　　蜈蚣藻于2009年12月購于江蘇昆山一弘藻業(yè)有限公司，由浙江海洋學院趙盛龍教授鑒定蜈蚣藻（Grateloupia filicina）。<

25、;/p><p>　　工業(yè)甲醇；Folin-Ciocalteu 試劑；碳酸鈉；沒食子酸；甲醇；石油醚；乙酸乙酯；正丁醇；二苯代苦味?；杂苫?DPPH)；鄰二氮菲；磷酸二氫鈉；磷酸氫二鈉；硫酸亞鐵；雙氧水（30%）；鐵氰化鉀；氯化鐵；三氯乙酸；（以上試劑除工業(yè)甲醇外，均為分析純，并購買于國藥集團化學試劑有限公司）。</p><p><b>　　2.2 主要儀器</b><

26、;/p><p><b>　　3 實驗方法</b></p><p>　　3.1 蜈蚣藻多酚的提取</p><p>　　提?。喝》鬯榈尿隍荚宸勰┯?倍量工業(yè)甲醇浸泡三次(每次72小時)，合并浸提液。減壓濃縮，用甲醇脫鹽三次，抽濾，合并三次濾液，減壓濃縮后得浸膏，備用。</p><p>　　萃?。航嗉铀畱腋?，依次用石油醚、乙酸乙

27、酯和正丁醇各萃取三次，每次萃取溶劑與水溶液體積比1:1，分別合并石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層，減壓濃縮，得萃取物。</p><p><b>　　操作流程：</b></p><p>　　樣品處理→超聲波→抽濾→減壓濃縮→脫鹽→減壓濃縮→粗浸膏→濃縮物用水溶解→石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取→石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相萃取物減壓濃縮→浸膏。</p>&l

28、t;p>　　3.2 蜈蚣藻多酚含量的測定</p><p>　　多酚含量測定[13]：以AOAC(1970)的標準分析方法測定，即用Folim-Denis試劑在堿性條件下與多酚類物質形成藍色復合物后，用紫外-可見分光光度計作比色分析[14]。</p><p>　　3.2.1沒食子酸標準曲線的繪制</p><p>　　取濃度為0.05 mg/mL的沒食子酸溶液（稱

29、取 0.05g沒食子酸，用蒸餾水定容于1000 mL容量瓶中）0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL在10 mL分別加入試管內，然后加入0.1mL福林酚試劑，放置3 min后加入2%的Na2CO3 2 mL，轉移至5ml容量瓶中，用蒸餾水定容到5 mL，在25℃下反應30 min后，于760 nm測其吸光度，每個濃度平行測定3次，分別記錄吸光值，以平均值做標準曲線。</p><p>

30、　　調零：加0.1ml福林酚試劑，2%碳酸鈉溶液2ml，后用蒸餾水定容至5ml。</p><p>　　3.2.2 蜈蚣藻多酚含量測定</p><p>　　取蜈蚣藻粗提物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相萃取物各10mg，各用1ml甲醇溶解，配制成10 mg/mL的樣品溶液。取樣品溶液0.5 mL，置于10 mL的試管內，然后加入0.1 mL福林酚試劑，3 min后加入2％碳酸鈉溶液2 mL，

31、再用蒸餾水定容到5 mL，25 ℃下反應30 min，在760 nm處測定吸光度，平行測3次。</p><p>　　調零：加0.1ml福林酚試劑，2%碳酸鈉溶液2ml，后用蒸餾水定容至5ml。</p><p>　　3.3 蜈蚣藻多酚抗氧化活性的測定</p><p>　　3.3.1 清除DPPH 自由基能力的測定（DPPH 法）[15]</p><

32、p>　　分別取蜈蚣藻取粗提物和各相萃取物3ml加3mL DPPH（甲醇溶液，0.2 mmol/L，該溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配），混合均勻后室溫暗處放置30 min，于517 nm處測定吸光度Asample；分別取粗提物和各相萃取物3ml加入3 mL甲醇溶液于517 nm處測定吸光度Asample blank；3 mL DPPH中加入3 mL甲醇于517 nm處測定吸光度Acontrol； 6 ml甲醇于517 nm處測定吸光度Ablank。

33、平行測定三次，計算平均值。蜈蚣藻多酚樣品對DPPH的清除率按下式計算[16] ，用Ablank管調零。</p><p>　　清除率(%)=[1–(Asample–Asampleblank)/(Acontrol–Ablank)]×100%</p><p>　　3.3.2 清除羥自由基能力的測定[17]</p><p>　　取濃度為0.75mmol/ L 鄰二

34、氮菲1 mL于試管中，加入0.2mol/L磷酸緩沖溶液（PBS，pH值為7.40）2 mL，充分混勻后，加入濃度為0.75 mmol/ L的硫酸亞鐵1 mL，混勻，加質量分數為0.1% 的H2O2 1 mL，再加1 mL蒸餾水至6 mL，于37 ℃水浴60 min，于536 nm處測其吸光度，為A536損傷；用1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2，為A536空白；分別用蜈蚣藻粗提物和各相萃取物代替1 mL的蒸餾水，為A536加樣。蜈蚣藻

35、多酚樣品對羥自由基的清除率(E)按下式計算[16]，用甲醇調零。</p><p>　　E(%)=(A536加樣-A536損傷)/(A536空白-A536損傷)×100%</p><p>　　3.3.3 Fe還原力的測定[18]</p><p>　　分別取蜈蚣藻取粗提物和各相萃取物1ml，加0.2mol/L PBS（PH=6.6）1ml，再加1%鐵氰化鉀1m

36、l，置于50°C水浴中20min，加入10%三氯乙酸（TCA）1ml混合后，以8000r/min離心5min，取其1ml上清液，加蒸餾水1ml，再加入0.1%FeCl3 0.2ml，混合均勻靜置10min，于700nm下測其吸光度。調零：甲醇1ml+0.2mol/L PBS（PH=6.6）1ml+1%鐵氰化鉀1ml。</p><p><b>　　4 實驗結果與討論</b></

37、p><p>　　4.1 蜈蚣藻多酚的含量</p><p>　　4.1.1 沒食子酸標準曲線</p><p>　　以吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線?；貧w方程y=74.127x + 0.0689，R2 =0.9960，結果表明沒食子酸濃度在0.001—0.01mg/ml范圍內與其吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關系。</p><p>　　4

38、.1.2 蜈蚣藻取粗提物和各相萃取物多酚的含量[19]</p><p>　　蜈蚣藻取粗提物和各相萃取物測得的吸光度值與沒食子酸標準曲線比較，總酚含量（GAE）表示為每克樣品干重相當于沒食子酸的量（GAE：mg沒食子酸/g樣品干重)。</p><p>　　表一 蜈蚣藻取粗提物和各相萃取物多酚的含量</p><p>　　表一可看出蜈蚣藻的粗提物和各相萃取物均含有一定量的

39、多酚成分，其中乙酸乙酯相萃取物酚類含量最高（10.32 mg/g），粗提物分類含量最低（2.484 mg/g）。</p><p>　　4.2 蜈蚣藻多酚的抗氧化活性</p><p>　　4.2.1 清除DPPH自由基能力的測定</p><p>　　DPPH 在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其結構中有1 個孤對電子，其溶液在517 nm處具有紫紅色特征吸收

40、峰。當存在自由基清除劑時，與其單電子配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，而且這種顏色變淺的程度與配對電子數是成量效關系的，因此可用于檢測自由基的清除情況，從而評價實驗樣品的抗氧化能力。 </p><p>　　從圖二可得出各相萃取物和粗提物對DPPH的清除隨濃度的增大清除率增大，且石油醚相>乙酸乙酯相>正丁醇相>粗提物。石油醚相對DPPH的清除在10mg/ml時甚至達到100%。此外

41、，在這個實驗中所做的空白實驗是在不加樣品的情況下，用測定樣品相同的方法、步驟進行定量分析，把所得結果作為空白值，從樣品的分析結果中扣除，從而消除由于試劑不純或試劑干擾等所造成的系統(tǒng)誤差，進而減小實驗誤差。</p><p>　　4.2.2 清除羥自由基能力的測定</p><p>　　鄰二氮菲-Fe2+是常用的氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原狀態(tài)的改變。H2O2/Fe2+體系

42、通過Fenton反應產生羥自由基，鄰二氮菲-Fe2+水溶液可被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+，從而使鄰二氮菲-Fe2+在536nm處的最大吸收峰消失。當加入還原性物質后，它可以與羥自由基反應，從而使Fe2+免遭氧化，吸光度比原來增大，因此可用于檢測自由基的清除情況，從而評價實驗樣品的抗氧化能力。</p><p>　　由圖三可知對羥自由基的清除：石油醚相>粗提物>乙酸乙酯相>正丁醇相。而其中石油

43、醚相對羥自由基的清除率增幅最大，且石油醚相對羥自由基的清除在5g/ml時甚至達到100%。正丁醇相對羥自由基的清除隨濃度（1-5mg/nl）的增大其清除率增幅很小。</p><p>　　4.2.3 鐵還原力能力的測定</p><p>　　鐵還原力的測定通常用來評價天然抗氧化劑的供電子能力，抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子而使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子，從而失去活性。Fe3+溶液呈淡黃色，當Fe

44、3+被樣品中的抗氧化劑還原為Fe2+時，溶液的顏色就變?yōu)樗{色,藍色越深表示樣品還原能力越強。通過測定反應混合物700nm處吸光度來評價化合物的還原力，吸光度越大，還原力越強。</p><p>　　由圖四可得出Fe還原力的大?。菏兔严?gt;乙酸乙酯相>正丁醇相>粗提物，其中正丁醇相和粗提物的對Fe還原力的大小和增幅都很相近，與石油醚相和乙酸乙酯相相差甚遠。</p><p>&

45、lt;b>　　4.3 討論</b></p><p>　?。?）比較三種不同抗氧化方法得出的結果：對DPPH的清除（1-10mg/ml）：石油醚相>乙酸乙酯相>正丁醇相>粗提物；對羥自由基的清除（1-5mg/ml）：石油醚相>粗提物>乙酸乙酯相>正丁醇相；Fe還原力的大?。?-25mg/ml）：石油醚相>乙酸乙酯相>正丁醇相>粗提物?？删C合得出

46、，抗氧化能力的大?。菏兔严?gt;乙酸乙酯相>正丁醇相>粗提物。鄰二氮菲法對于測定抗氧化能力靈敏度較高，但可能也因此得出的結果相對不是特別穩(wěn)定，故需與其他抗氧化方法一起使用以得出較精準的實驗結果。</p><p>　?。?）DPPH具有刺激性，吸入、口服或皮膚接觸有害，而且在使用時須現(xiàn)用現(xiàn)配，用棕色瓶裝，并且避光。因為它在環(huán)境中不穩(wěn)定，所以此操作是在暗處進行的，否則會影響到抗氧化能力的測定。<

47、/p><p>　　（3）Fenton反應是體內產生羥自由基的重要機理，羥自由基是造成組織脂過氧化、蛋白質解聚與聚合、核酸斷裂、多糖解聚的重要活性氧。羥自由基清除率是反應藥物抗氧化作用的重要指標。該文采用的羥自由基模型體系中，加入的雙氧水自身會產生氣體，所以在測紫外時，使得吸光度值不穩(wěn)定，一直在變化，使得到的數據存在一定的誤差，從而影響到清除率的計算。因此反應液需要在37℃水浴中充分反應1 h 以后再測紫外。</

48、p><p>　　（4）在減壓濃縮過程中，壓強如果能降到-1以下，此時溶劑能很快地被蒸餾出來，說明真空度越高，溶劑越快達到沸點；如果抽濾泵工作時間過長，真空度就會下降，從而蒸餾速度會變慢，所以要及時更換抽濾泵中的水，以確保有較高的真空度；如果外界氣溫較高，可以在循環(huán)真空泵水泵中加入適量冰塊來降低水溫或者使用循環(huán)水式多用真空泵，可以使冷凝管中的水溫控制在8℃以下，從而獲得較高的真空度，進而加快溶劑的蒸餾；如果把旋轉的速度

49、加快，則使得圓底燒瓶的每一個部位的溫度都幾乎一致，此時也會加快蒸餾。</p><p>　?。?）在蒸餾過程中如果要中斷蒸餾，應先關掉熱源，再打開活塞，使系統(tǒng)與大氣相通，待系統(tǒng)內外壓力平衡后方可關掉抽濾泵開關，否則會引起倒吸；在蒸餾時，液體裝至瓶子體積的1/2到2/3為好，液面太高將過早沸騰，會把需要的東西一起蒸餾出去；為了更好的蒸餾，在連接裝置與圓底燒瓶之間，加一個防沸球，這樣可以預防溶液未提純而直接沖到蒸餾液中

50、。</p><p><b>　　5結論</b></p><p>　　在粗提物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相中，石油醚相有最高的DPPH清除率、羥自由基清除率、Fe還原能力，且其清除能力與濃度成量效關系?？偡雍颗c蜈蚣藻各提取物的抗氧化活性之間具有一定的相關性。因此，多酚類物質可能是蜈蚣藻各提取物的主要抗氧化成分之一，石油醚相抗氧化能力最強，是一類潛在的海洋生物天然抗

51、氧化劑，從而為蜈蚣藻多酚的進一步開發(fā)利用提供依據。 </p><p><b>　　[參考文獻]</b></p><p>　　[1] 夏邦美.中國海藻志第二卷紅藻門第三冊[M].北京:科學出版社,2004:81-140.</p><p>　　[2] 盛建春,楊方美,胡秋輝. 海藻多糖生物活性研究[J]. 食品科學,2005,26（3）：262-2

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