山藥多酚氧化酶的提取和酶學(xué)性質(zhì)研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　論文題目：山藥多酚氧化酶的提取和酶學(xué)性質(zhì)研究</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </

2、p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p>　　畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）誠(chéng)信承諾書(shū)</p><p>　　1．本人承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)），是在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下嚴(yán)格按照學(xué)校和學(xué)院有關(guān)規(guī)定完成的，引用他人的觀點(diǎn)和參考資料均

3、加以注釋和說(shuō)明。</p><p>　　2．本人鄭重地承諾所上交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）沒(méi)有抄襲他人研究（設(shè)計(jì)）成果和偽造相關(guān)數(shù)據(jù)等行為。</p><p>　　3．畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）若有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。</p><p>　　學(xué)生簽名：__________</p><p>　　日 期：__________</

4、p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　多酚氧化酶（polyphenol oxidase,EC.1.10.3.1）是自然界中一類(lèi)分布極廣的金屬蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆蟲(chóng)體內(nèi)，能催化多酚類(lèi)氧化成醌類(lèi)。本實(shí)驗(yàn)以新鮮山藥為試驗(yàn)材料，采用丙酮粉沉淀抽濾法從新鮮山藥中提取多酚氧化酶，提取的粗酶液經(jīng)20％～50％硫酸銨分級(jí)沉淀，透析除鹽，得到一種活性較高

5、的多酚氧化酶，測(cè)其蛋白含量，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。用鄰苯二酚為底物，在420nm波長(zhǎng)下，采用分光光度法測(cè)定山藥多酚氧化酶的活力。研究了pH、溫度、底物濃度和抑制劑等不同因素對(duì)山藥多酚氧化酶活力的影響。結(jié)果表明，山藥提取液中蛋白含量為0.1038mg/mL；山藥多酚氧化酶的最適pH為5.6；最適溫度為35℃；由Lineweaver-Burk 方程得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)：Km為53.76mol/L，Vmax為0.3924U，山藥多酚氧化酶熱穩(wěn)定性實(shí)

6、驗(yàn)顯示，在50-100℃的溫度下水浴處理1h，酶活力均有所喪失，當(dāng)溫度達(dá)到85℃時(shí)，山藥多酚氧化酶徹底失活；隨酶液濃度的變大而成直線上升趨勢(shì)；L­半胱氨酸、檸檬酸、維生素C及NaCl四種抑制劑都能達(dá)到不同程度的抑制效果。</p><p>　　關(guān)鍵詞：山藥；多酚氧化酶；褐變；酶活力；抑制劑</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p>

7、;<p>　　Polyphenol oxidase (polyphenol oxidase,EC.1.10.3.1) is a very widely distributed tissue in nature, generally found in plants, fungi, insect, polyphenol compounds catalyzed by oxidized into Quinones. This ex

8、periment with fresh Yam for the test material, using acetone powder by precipitation filter extraction of polyphenols from fresh Yam activity, extraction of crude enzyme solution of ammonium 20%~50% fractional precipitat

9、ion, dialysis and desalting, get a high activity of polyphenol oxidase, it</p><p>　　Keywords: Dioscorea opposita; polyphenol oxidase; browning; activity; inhibitors</p><p><b>　　目 錄</b&

10、gt;</p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>　　2 材料與方法2</b></p><p>　　2.1材料與試劑2</p><p><b>　　2.2儀器3</b></p><p>　　2.3山藥多酚氧化酶的提取

11、3</p><p>　　2.3.1丙酮粉的制備3</p><p>　　2.3.2山藥多酚氧化酶粗酶液的制備3</p><p>　　2.3.3硫酸銨分級(jí)沉淀3</p><p>　　2.4山藥多酚氧化酶提取液蛋白含量測(cè)定4</p><p>　　2.5山藥多酚氧化酶的活性測(cè)定4</p><p&

12、gt;　　2.6山藥多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定5</p><p>　　2.6.1 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)5</p><p>　　2.6.2 pH值對(duì)PPO活性的影響5</p><p>　　2.6.3溫度對(duì)PPO活性的影響5</p><p>　　2.6.4 PPO的熱穩(wěn)定性測(cè)定5</p>&l

13、t;p>　　2.7抑制劑對(duì)PPO活力的影響5</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論6</b></p><p>　　3.1硫酸銨鹽析結(jié)果6</p><p>　　3.2 PPO提取液蛋白含量及比活計(jì)算6</p><p>　　3.3 山藥PPO酶學(xué)性質(zhì)分析7</p><p>　　3

14、.3.1 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖和動(dòng)力學(xué)常數(shù)7</p><p>　　3.3.2 pH值與PPO活性的關(guān)系8</p><p>　　3.3.3 溫度與PPO活性的關(guān)系8</p><p>　　3.3.4 PPO 熱穩(wěn)定性9</p><p>　　3.4抑制劑對(duì)PPO 活性的影響9</p><p>　

15、　3.4.1檸檬酸對(duì)PPO的抑制作用10</p><p>　　3.4.2 NaCl對(duì)PPO的抑制作用10</p><p>　　3.4.3 L­半胱氨酸對(duì)PPO的抑制作用11</p><p>　　3.4.4 抗壞血酸對(duì)PPO的抑制作用12</p><p><b>　　4 結(jié)論13</b></p&g

16、t;<p><b>　　參考文獻(xiàn)15</b></p><p><b>　　致 謝16</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　多酚氧化酶（EC.1.10.3.1）（polyphenol oxidase，PPO）是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多亞基含銅氧化還原酶，

17、屬六大類(lèi)酶中的第一大類(lèi)氧化還原酶[1]。它早在1895年就被發(fā)現(xiàn)，直至1937年才被分離得到。多酚氧化酶具有操作條件溫和，反應(yīng)專(zhuān)一性好等優(yōu)點(diǎn)[2]。其特征是能夠通過(guò)分子氧氧化酚或多酚形成對(duì)應(yīng)的醌[3]。在廣義上，多酚氧化酶可分為三大類(lèi)：?jiǎn)畏訂窝趸福ɡ野彼崦福瑃yrosinase，EC.1.14.18.1）、雙酚氧化酶（兒茶酚氧化酶，catechol oxidse，EC.1.10.3.2）和漆酶[4]（laccase，EC.1.10.3

18、.1）。在這三大類(lèi)多酚氧化酶中，兒茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶?，F(xiàn)在大部分文獻(xiàn)所說(shuō)的多酚氧化酶一般是兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱(chēng)。多酚氧化酶來(lái)源廣泛，在自然界中其分布極廣，普遍存在于植物、真菌、昆蟲(chóng)的質(zhì)體中，甚至在土壤中腐爛的植物殘?jiān)隙伎梢詸z測(cè)到多酚氧化酶的活性[4]。多酚氧化酶由于其檢測(cè)方便，是被最早研究的幾類(lèi)酶之一[5]。但是，也有研究表明，不同生物中的多酚氧化酶氨基酸數(shù)目差異很大，不同來(lái)源的多&

19、lt;/p><p>　　在高等植物中，多酚氧化酶是由核編碼的含銅的金屬蛋白酶，定位于質(zhì)體內(nèi)囊體，天然狀態(tài)無(wú)活性，但將組織勻漿或損傷后PPO被活化，從而表現(xiàn)出活性。當(dāng)多酚氧化酶與底物接觸相互作用，氧化底物產(chǎn)生活性的醌，醌自聚發(fā)生合并和細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)氨基酸基團(tuán)反應(yīng)，產(chǎn)生黑色和褐色物質(zhì)，這也是組織中酶促褐變的主要原因[7]。因此，多酚氧化酶是生物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶，與人的衰老，昆蟲(chóng)的傷口愈合與發(fā)育，果蔬的褐變有密切關(guān)系

20、[4,8]。然而山藥在加工和貯藏過(guò)程中很容易發(fā)生褐變，引起色澤、風(fēng)味和質(zhì)地的變化，從而影響山藥的商業(yè)價(jià)值。酶促褐變是果蔬加工過(guò)程中普遍存在的現(xiàn)象，尤其是發(fā)生在肉質(zhì)顏色較淺的水果、蔬菜上。當(dāng)果蔬受到機(jī)械損傷或處于不良環(huán)境，如受凍、受熱時(shí)，尤其在加工過(guò)程中，果蔬內(nèi)的多酚類(lèi)物質(zhì)在多酚氧化酶的催化作用下氧化而呈現(xiàn)褐色。褐變影響果品的營(yíng)養(yǎng)與外觀品質(zhì)，從而降低產(chǎn)品的商品品質(zhì)與市場(chǎng)售價(jià)。山藥PPO位于其正常細(xì)胞的質(zhì)體中，山藥受到損傷后，PPO釋放出來(lái)

21、。在有氧環(huán)境中，催化酚類(lèi)物質(zhì)為鄰醌，然后鄰醌繼續(xù)相互作用生成高分子聚合物或與氨基酸或與蛋白質(zhì)生成高分子絡(luò)合物，導(dǎo)致褐色素的生成。目前生產(chǎn)上普遍采用熏硫法來(lái)抑制山藥褐</p><p>　　近年來(lái)，隨著生物技術(shù)日新月異的發(fā)展，酶工程在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用起著越來(lái)越重要的作用[1]。多酚氧化酶的研究也一直受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，其研究涉及生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)等多個(gè)學(xué)科和領(lǐng)域，具有多種生理功能，如采用酶工程技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)品

22、的制備，污染物的檢測(cè)，精細(xì)化工產(chǎn)品的生產(chǎn)，免疫抗病性，降解木質(zhì)素，調(diào)控IAA、葉綠體的能量轉(zhuǎn)移等[2]。同時(shí)具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，與食品工業(yè)、三廢處理、醫(yī)藥衛(wèi)生關(guān)系較為密切，如用多酚氧化酶增強(qiáng)植物和固定化酶制品檢測(cè)環(huán)境中多酚類(lèi)物質(zhì)，處理工業(yè)“三廢”、化學(xué)農(nóng)藥降解產(chǎn)生的酚和芳胺等，具有較大的開(kāi)發(fā)價(jià)值[9]。</p><p>　　目前，多酚氧化酶在生化、生物學(xué)性質(zhì)方面的研究已取得了較大進(jìn)展，人們一直在研究多酚氧化酶活性

23、的抑制劑和激活劑，以多酚氧化酶作為研究對(duì)象尋找更好的美白劑。有研究表明，其抑制劑熊果甙和曲酸可被作為化妝品中的增白劑，為色素沉著、黑色素瘤以及白癜風(fēng)等色素疾病的預(yù)防和治療尋找新的手段[10]。現(xiàn)在多酚氧化酶的研究主要集中在酶的分離純化、催化機(jī)制、活性調(diào)控以及多酚氧化酶基因及其在生物體內(nèi)的生理作用等方面，雖然人們已經(jīng)從微生物、植物及多種動(dòng)物中提取并純化了多酚氧化酶，但在結(jié)構(gòu)方面，其三維結(jié)構(gòu)仍未得到，同時(shí)不同生物體中提取的多酚氧化酶種類(lèi)也不

24、同，同工酶的存在為多酚氧化酶的研究增加了難度[6]。因此，此項(xiàng)研究還需要人們不斷尋找不同來(lái)源的多酚氧化酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和功能進(jìn)行研究。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)針對(duì)山藥易褐變，難保存，主要是探索酶的基本性質(zhì)和為防止褐變進(jìn)行基礎(chǔ)研究。對(duì)多酚氧化酶特性進(jìn)一步加以認(rèn)識(shí)研究，探討山藥中多酚氧化酶的活力、最適pH、最適溫度、多酚氧化酶的熱穩(wěn)定性以及不同抑制劑對(duì)多酚氧化酶活性的影響等，從而為進(jìn)一步研制出新型藥物和化妝品等

25、提供理論依據(jù)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1材料與試劑</b></p><p>　　山藥（市售）；牛血清白蛋白（BR）；丙酮、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙醇、抗壞血酸、（NH4）2SO4、磷酸、氯化鈉、L­半胱氨酸、鄰苯二酚，均為分析純化學(xué)試劑。</p&g

26、t;<p><b>　　2.2儀器</b></p><p>　　本研究所采用的主要儀器和設(shè)備如表1所示。</p><p>　　表1 主要儀器和設(shè)備</p><p>　　2.3山藥多酚氧化酶的提取</p><p>　　2.3.1丙酮粉的制備</p><p>　　稱(chēng)取50g已去皮的新鮮

27、山藥，迅速用不銹鋼刀切片，然后加入200mL丙酮（-20℃預(yù)冷），用高速組織搗碎機(jī)攪拌，混勻后抽濾，取濾餅真空干燥后得丙酮粉，置（-20℃）下備用。</p><p>　　2.3.2山藥多酚氧化酶粗酶液的制備</p><p>　　稱(chēng)取1g丙酮粉，加入50mL Mcllvaine緩沖液（0.2mol/L磷酸氫二鈉-0.1mol/L檸檬酸，pH5.6），用攪拌機(jī)高速攪拌15min，4000r/m

28、in離心20min，上清液即PPO粗酶液。</p><p>　　2.3.3硫酸銨分級(jí)沉淀</p><p>　?。?）取粗酶液6份，每份10mL分別緩慢加入固體硫酸銨粉末至終濃度為10%-60%，進(jìn)行(NH4)2SO4沉淀1h，4℃，用6000rpm，4℃的低溫離心機(jī)離心10min。沉淀用10mL Mcllvaine緩沖液溶解。分別測(cè)上清液和沉淀溶解液酶活。</p><p

29、>　?。?）鹽析：將粗酶液用20%的硫酸銨溶液鹽析4℃靜置2h，6000rpm離心10min，4℃，去除沉淀，保留上清液。然后將上清液加入硫酸銨進(jìn)行50%的硫酸銨溶液鹽析，4℃靜置2h，6000rpm離心10min，4℃，去除上清液，用pH5.6的Mcllvaine緩沖液將離心好的沉淀溶解掉（使用的溶解液要盡量少）。</p><p>　　（3）透析：將上一步溶解好的溶液裝入處理好的透析袋中，放入500mL的

30、燒杯上，裝入pH5.6的Mcllvaine緩沖液500mL，用磁力攪拌機(jī)攪拌，并放入4℃的層析柜中，每3小時(shí)換一下透析液，透析12h。即獲得多酚氧化酶提取液，收集并保存于-20℃下備用。</p><p>　　2.4山藥多酚氧化酶提取液蛋白含量測(cè)定</p><p>　　采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定酶提取液中蛋白質(zhì)的含量。</p><p>

31、;　　2.4.1考馬斯亮藍(lán)試劑的配置</p><p>　　考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1000mL，濾紙過(guò)濾。最終試劑中含10%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。</p><p>　　2.4.2標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液</p><p>　　牛血清

32、血蛋白，根據(jù)其純度用0.15mol/L NaCl配制成100µg/mL蛋白原液。</p><p>　　2.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作</p><p>　　表2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度測(cè)定</p><p>　　以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　2.4.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定</p>

33、<p>　　將酶提取液，依照以上表格操作，測(cè)出樣品的A595nm，然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程求出樣品蛋白質(zhì)含量。</p><p>　　2.5山藥多酚氧化酶活性測(cè)定</p><p>　　在光徑1cm的比色皿中，加入Mcllvaine緩沖液100µL，0.2 mol/L的鄰苯二酚900µL，PPO粗酶液20µL，混勻，在35℃下測(cè)定PPO的活性。溶液

34、快速混勻后于420nm處測(cè)其吸光度，60s內(nèi)記錄酶活度，以初始直線段的斜率（△OD/ t） 計(jì)算酶活力。相對(duì)酶活力單位（U）定義為：在測(cè)定條件下，每分鐘引起吸光度改變1所需的酶量。</p><p>　　2.6山藥多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定</p><p>　　2.6.1 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)</p><p>　　配制0.03-0.2mo

35、l/L不同濃度的鄰苯二酚，作為底物，在pH5.6，35℃條件下，測(cè)定不同底物濃度下山藥PPO的活性。作1/v與1/[S]雙倒數(shù)圖，從所得曲線計(jì)算山藥多酚氧化酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)：米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率常數(shù)Vmax。</p><p>　　2.6.2 pH值對(duì)PPO活性的影響</p><p>　　配制pH值3~7.5的系列Mcllvaine緩沖液，按上述方法分別測(cè)定不同pH值的Mcllvaine

36、緩沖液與酶液及底物混勻后的吸光度，即在試管中加入已配好的不同pH值的Mcllvaine緩沖液100µL，0.2 mol/ L的鄰苯二酚900µL，PPO粗酶液20µL，在35℃下測(cè)定山藥PPO的活性。</p><p>　　2.6.3溫度對(duì)PPO活性的影響</p><p>　　試管中，以0.2mol/L的鄰苯二酚溶液1800µL為底物，加入pH5.6的

37、Mcllvaine 緩沖液200µL，在不同溫度（20~60℃的溫度條件）下保溫10min，取出1000µL置比色皿中，加入相同溫度下保溫10min的PPO粗酶液20µL，混勻后迅速測(cè)定PPO的酶活。</p><p>　　2.6.4 PPO的熱穩(wěn)定性測(cè)定</p><p>　　取120µL PPO酶液，在50、60、70、80、90、100 ℃下水浴6

38、0min 后取出、冷卻，在8000r/min下離心5 min，取上清，加入含900µL 0. 2 mol/L鄰苯二酚和100µL Mcllvaine緩沖液的底物體系，混勻后測(cè)定PPO的酶活，以未經(jīng)熱處理的酶液為對(duì)照。</p><p>　　2.7抑制劑對(duì)PPO活力的影響</p><p>　　取30µL PPO酶液和等體積不同濃度的30µL抑制劑（檸檬酸

39、、NaCl、抗壞血酸、L­半胱氨酸）混合，35℃水浴3h。取550µL 0.2mol/L鄰苯二酚溶液，與550µL同一抑制劑溶液混合，35℃水浴10min，取1000µL作為底物。取20µL含抑制劑的酶液，與底物混勻后迅速測(cè)定PPO的酶活。設(shè)立不含抑制劑的測(cè)活體系作為空白對(duì)照。計(jì)算剩余酶活力（%），以抑制劑濃度為橫坐標(biāo)，剩余酶活力為縱坐標(biāo)作圖。</p><p>&

40、lt;b>　　3 結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1硫酸銨鹽析結(jié)果</p><p>　　粗酶液用不同濃度硫酸銨鹽析后，分別測(cè)定上清液和沉淀的PPO酶活力，所得結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，10%-40%硫酸銨鹽析后上清液酶活較大，而50-60%硫酸銨鹽析后上清液酶活力剩余較少；10%-40%硫酸銨鹽析后沉淀酶活較小，而50-60%硫酸銨鹽析后所得的沉淀酶活較大。根

41、據(jù)該結(jié)果，我們選擇20%硫酸銨鹽析來(lái)去除粗酶液部分雜質(zhì)，采用50%硫酸銨鹽析來(lái)收集PPO沉淀。</p><p>　　表3 硫酸銨分級(jí)沉淀結(jié)果</p><p>　　3.2 PPO提取液蛋白含量及比活計(jì)算</p><p>　　以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)此作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如下：</p><p>　　圖1

42、標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線</p><p>　　可得直線方程為：A595nm=0.0073x+0.4645</p><p>　　酶提取液測(cè)得A595nm=1.222</p><p>　　由方程計(jì)算得x=103.8µg/mL</p><p>　　山藥提取液中蛋白含量為0.1038mg/mL，測(cè)定酶活力，求得山藥多酚氧化酶提取液的比活為213.3

43、U/mg</p><p>　　3.3 山藥PPO酶學(xué)性質(zhì)分析</p><p>　　3.3.1 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖和動(dòng)力學(xué)常數(shù)</p><p>　　表4 不同濃度底物下的酶活力</p><p>　　根據(jù)表3作雙倒數(shù)圖如下：</p><p>　　圖2 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖</

44、p><p>　　可得直線方程為：y=0.0474x+2.5481，根據(jù)圖可求出最大反應(yīng)速率Vmax=0.3924 U，米氏常數(shù)Km=53.76 mol/L。</p><p>　　3.3.2 pH值與PPO活性的關(guān)系</p><p>　　圖3 pH對(duì)PPO活力的影響</p><p>　　由圖3結(jié)果表明，山藥中多酚氧化酶活力隨pH值升高而增強(qiáng)，到pH

45、為5.6時(shí)山藥多酚氧化酶的酶活最高，繼續(xù)升高pH后使山藥PPO活力下降。這是因?yàn)镻PO是一種含銅的蛋白質(zhì)，在pH較低時(shí)，輔基銅將以Cu2+的形式解離出來(lái)，從而使PPO失去活性；而在堿性條件下，輔基銅會(huì)解離生成不溶性氫氧化銅，從而使PPO的活性顯著降低。韓富根等在煙草葉片多酚氧化酶的提取及其特征研究中指出，pH值為6.0時(shí)，多酚氧化酶活性最高；在偏堿條件下，酶的活性下降快[11]。于新等研究表明，草菇多酚氧化酶表現(xiàn)最適活性的pH值6.0~

46、6.8[12]。可見(jiàn)，不同植物PPO活性最適pH值差異很大。因此在山藥加工過(guò)程中，調(diào)節(jié)pH值能有效抑制酶促褐變，pH值對(duì)PPO活性影響顯著。</p><p>　　3.3.3 溫度與PPO活性的關(guān)系</p><p>　　圖4 溫度對(duì)PPO活力的影響</p><p>　　由圖4結(jié)果表明，山藥中PPO活力隨溫度的升高而增強(qiáng)，35℃時(shí)活力最高，當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)其活力開(kāi)始下降

47、，在35-60℃范圍內(nèi)其下降趨勢(shì)平緩。由圖可以看出，山藥中多酚氧化酶活力最高時(shí)的溫度在35℃左右，溫度的變化影響了酶的活力，酶的活力隨溫度的下降到25℃后顯著降低。PPO的耐熱性都較差， 一般在70℃以上的高溫處理后，酶活性顯著降低。因此山藥加工過(guò)程中可采用熱燙鈍化PPO的活性，抑制褐變的發(fā)生。在山藥的貯藏過(guò)程中也要考慮溫度的影響，應(yīng)低于25℃。Mespilus germanica L，Rosacea 也曾報(bào)道了歐楂果中多酚氧化酶在35

48、℃時(shí)其活力最大[13] 。</p><p>　　3.3.4 PPO 熱穩(wěn)定性</p><p>　　圖5 PPO的熱穩(wěn)定性曲線</p><p>　　圖5表明將酶液放置于50-100℃溫度下水浴處理1h，冷卻至35℃后進(jìn)行酶活力測(cè)定。結(jié)果表明：雖然酶在50-60℃下活力較高，但經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間（1h） 高溫處理后，酶就會(huì)失去部分活力。當(dāng)溫度高于85℃，酶就徹底失活。這是因?yàn)椴?/p>

49、適宜的溫度破壞了PPO活性部分三維結(jié)構(gòu)的完整性，從而影響其活性。 </p><p>　　3.4抑制劑對(duì)PPO 活性的影響</p><p>　　抑制劑對(duì)多酚氧化酶的作用機(jī)理是作用于產(chǎn)物的還原或抑制酶的活性。PPO的輔基為銅離子，從理論上說(shuō)，有兩種類(lèi)型的抑制劑：其一，與銅離子作用從而抑制酶活性的物質(zhì)；其二，影響底物與酶作用部位結(jié)合的物質(zhì)。抑制劑的研究對(duì)于山藥加工過(guò)程防止褐變具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

50、</p><p>　　3.4.1檸檬酸對(duì)PPO的抑制作用</p><p>　　圖6 檸檬酸對(duì)PPO活力的抑制作用</p><p>　　從圖6中可以看出，在檸檬酸濃度0~0.2（mol/L）內(nèi)，隨著檸檬酸濃度的不斷增大，山藥中多酚氧化酶的活力逐漸減小，多酚氧化酶活力受到了抑制。當(dāng)檸檬酸濃度達(dá)到0.02mol/L后，再隨濃度的升高，山藥多酚氧化酶的活性下降趨勢(shì)趨于平緩。

51、而且在濃度超過(guò)0.07mol/L時(shí)，酶活性只有原來(lái)的24%。這表明提高檸檬酸的濃度能有效地抑制PPO的活性。原因是：酸性溶液既可以降低pH值，抑制對(duì)多酚氧化酶的活力，酸性溶液中氧氣溶解度較小而兼有抗氧化作用。檸檬酸中羰基可與多酚氧化酶的銅離子產(chǎn)生比較強(qiáng)的螯合作用，對(duì)山藥多酚氧化酶的活力有一定抑制[14]。</p><p>　　3.4.2 NaCl對(duì)PPO的抑制作用</p><p>　　圖7

52、 NaCl對(duì)PPO活力的抑制作用</p><p>　　從圖7中可以看出，NaCl的濃度在0~0.15（mol/L）內(nèi)，隨著NaCl的濃度不斷增大，山藥多酚氧化酶的活力不斷減小，多酚氧化酶活力受到了抑制。當(dāng)NaC濃度達(dá)到0.15mol/L后，再隨濃度的升高，山藥多酚氧化酶的活性下降趨勢(shì)趨于平緩。而且在濃度超過(guò)0.2mol/L時(shí)，酶活性只有原來(lái)的28%。原因是：NaCl溶于水后，能減少水中的溶解氧，從而使酚類(lèi)氧化酶難

53、與氧直接接觸，且鈉離子與多酚氧化酶中銅離子競(jìng)爭(zhēng)，降低了多酚氧化酶的活力[15]。且食鹽溶液具有高的滲透壓，也可以使酶脫水失活。但過(guò)高濃度的NaCl溶液會(huì)影響懷山藥的口感，對(duì)人體也較為不利，不宜采用過(guò)高濃度的食鹽對(duì)山藥進(jìn)行處理。</p><p>　　3.4.3 L­半胱氨酸對(duì)PPO的抑制作用</p><p>　　圖8 L­半胱氨酸對(duì)PPO活力的影響</p>

54、<p>　　從圖8中可以看出，隨著L­半胱氨酸濃度的不斷增大，山藥多酚氧化酶的活力不斷減小，多酚氧化酶活力受到了抑制，當(dāng)其濃度超過(guò)200µmol/L時(shí)，其活力幾乎被徹底抑制，抑制效果較好。L­半胱氨酸對(duì)PPO活性的抑制作用是和酶促褐變反應(yīng)的中間產(chǎn)物醌生成穩(wěn)定的無(wú)色物質(zhì)，抑制了次級(jí)氧化和聚合反應(yīng)，阻止了黑色素的生成。由于L­半胱氨酸對(duì)醌有偶合作用，從而起到了抑制的作用[16]。對(duì)L

55、73;半胱氨酸的抑制機(jī)理至今仍然存在爭(zhēng)議：一種觀點(diǎn)認(rèn)為，褐變被抑制主要是因?yàn)榈孜锓颖谎趸笊甚?，不與其他醌類(lèi)、氨基酸和蛋白質(zhì)等聚合生成有色物質(zhì)，而是直接與L­半胱氨酸結(jié)合形成一種新的無(wú)色硫氫化合物；另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為，由于L­半胱氨酸中的­SH基團(tuán)對(duì)Cu具有很強(qiáng)的親合力，可以去除PPO活性中心的銅或取代與活性中心的銅緊密配合的組氨酸殘基，通過(guò)對(duì)活性中心的結(jié)構(gòu)性修飾使酶活降低；也有研究者認(rèn)為這兩種機(jī)制并存。針

56、對(duì)L­半胱氨酸對(duì)山藥多酚氧化酶的真正抑制機(jī)理還需進(jìn)一步探討研究。</p><p>　　3.4.4 抗壞血酸對(duì)PPO的抑制作用</p><p>　　圖9 抗壞血酸對(duì)PPO活力的影響</p><p>　　從圖9中可以看出，在抗壞血酸濃度在0~20（µmol/L）內(nèi)，隨著抗壞血酸濃度的不斷增大，山藥多酚氧化酶的活力不斷減小，多酚氧化酶活力也受到了抑制。

57、然而在濃度在20~80（µmol/L）內(nèi)，隨著濃度的升高，山藥多酚氧化酶的活性下降速度趨于平緩。當(dāng)其濃度超過(guò)100µmol/L時(shí)，其活力幾乎被徹底抑制?？箟难釋?duì)PPO活性的抑制機(jī)理是將酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物鄰二醌還原為鄰二酸和脫氫抗壞血酸，防止中間產(chǎn)物進(jìn)一步聚合成黑色素而抑制褐變；抗壞血酸對(duì)褐變的抑制效果在很大程度上取決于它的濃度，只有反應(yīng)體系中有較高濃度的抗壞血酸，才能不斷還原酶促反應(yīng)生成的醌，直到酶失活為止。抗壞血

58、酸為山藥的固有營(yíng)養(yǎng)成分，安全性高，是理想的褐變抑制劑。</p><p>　　表5 四種抑制劑抑制效果的比較</p><p>　　不同濃度的檸檬酸、NaCl、抗壞血酸、均對(duì)山藥PPO活性的抑制有比較明顯的效果。由抑制結(jié)果可知：對(duì)山藥多酚氧化酶活性抑制效果的大小順序是L­半胱氨酸>抗壞血酸>檸檬酸>NaCl。其中L­半胱氨酸對(duì)山藥PPO活力抑制作用最好。

59、在實(shí)際生產(chǎn)中較為理想的抑制劑是抗壞血酸和L­半胱氨酸。它們既有較好的抑制效果，又是食品中固有的營(yíng)養(yǎng)成分，且安全性高。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　根據(jù)酶反應(yīng)初速與底物濃度的定量關(guān)系及米氏方程進(jìn)行Km與Vmax的計(jì)算，得出反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程：y=0.0474x+2.5481，R2=0.9733。在底物濃度0.03～0.2mo

60、l/L之間，pH值5.6，溫度35℃時(shí)，根據(jù)方程可求出最大反應(yīng)速度Vmax=0.3924U，米氏常數(shù)Km=53.76mol/L。</p><p>　　在一定pH值條件下多酚氧化酶的活性受溫度影響也較大，溫度過(guò)低抑制了山藥中多酚氧化酶的活性，而溫度過(guò)高，容易導(dǎo)致多酚氧化酶失去活性，通過(guò)在一定pH值的不同溫度的條件下對(duì)多酚氧化酶活性研究發(fā)現(xiàn)，山藥多酚氧化酶的最適溫度是35℃。</p><p>

61、　　將該酶在50~100℃的溫度下水浴處理1h，酶活力均有所喪失，當(dāng)溫度達(dá)到85℃時(shí)，徹底失活。在一定的溫度下的酸性環(huán)境中，山藥多酚氧化酶表現(xiàn)出的活力隨著pH增大不斷增大，當(dāng)pH為5.6 時(shí)酶活力達(dá)到最大值，山藥多酚氧化酶活力的適宜pH偏酸性。這跟大多數(shù)陸生植物中多酚氧化酶活力的最適pH值在酸性區(qū)域相符合。</p><p>　　從以上各抑制劑對(duì)PPO活力的影響圖表中可以看出，供試的幾種抑制劑對(duì)PPO活力均有一定的

62、抑制作用，抗壞血酸濃度達(dá)到100µmol/L與L­半胱氨酸濃度達(dá)200µmol/L，山藥多酚氧化酶活性幾乎被徹底抑制。而NaCl濃度濃度達(dá)到0.2mol/L與檸檬酸濃度達(dá)到0.07mol/L以上，對(duì)山藥多酚氧化酶的抑制才更明顯。在反應(yīng)體系中，抗壞血酸既可以作為醌類(lèi)的還原劑又可以作為酶分子中銅離子的螯合劑，或起到競(jìng)爭(zhēng)性的抑制作用，抗壞血酸不但能降低體系中的醌類(lèi)及其衍生物還原成酚，并通過(guò)自身氧化來(lái)減少體系中的含

63、氧化量。另外，抗壞血酸對(duì)反應(yīng)體系的影響，很大程度取決于抗壞血酸的濃度大小。L­半胱氨酸對(duì)山藥多酚氧化酶的效應(yīng)為不可逆的抑制。我們認(rèn)為L(zhǎng)­半胱氨酸也可與山藥PPO酶蛋白不可逆地結(jié)合從而抑制其酶促反應(yīng)。因此，L­半胱氨酸抑制山藥PPO的作用機(jī)理在于它既可作用于產(chǎn)物多巴醌生成穩(wěn)定的無(wú)色物質(zhì)又可通過(guò)與酶蛋白不可逆結(jié)合而作用于酶蛋白。然而檸檬酸的抑制效果比NaCl好，是因?yàn)闄幟仕嵩谝种泼复俸肿兎矫婢哂须p重作用，不但可

64、以作為酸味劑降低體系中的pH值，使山藥多酚氧化酶遠(yuǎn)離其最適作用范圍而降低酚酶的活性，另外，檸檬</p><p>　　以上研究表明抗壞血酸、檸檬酸、NaCl、L­半胱氨酸這些均是多酚氧化酶的抑制劑，天然的多酚氧化酶活性抑制劑可能是一種替代非天然多酚氧化酶活性抑制劑的先導(dǎo)化合物的良好來(lái)源。</p><p>　　總結(jié)：針對(duì)山藥易褐變，難保存，PPO是酶促褐變的主要因素，PPO活性高的山

65、藥品種易褐變。因此在山藥加工中，為避免褐變影響食品的外觀質(zhì)量及其內(nèi)含蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可通過(guò)向山藥中添加抗氧化劑（ 如抗壞血酸、L­半胱氨酸等）而有效地防止褐變的發(fā)生；或在生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中，都要盡量避開(kāi)PPO的適宜溫度及pH值，從而盡可能減少褐變帶來(lái)的影響，以保證其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[

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73、，從論文的選題、試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、資料收集、實(shí)驗(yàn)開(kāi)展到論文的完稿，斯老師均給予了詳盡的指導(dǎo)。導(dǎo)師淵博的知識(shí)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度和精益求精的工作作風(fēng)，求實(shí)創(chuàng)新及忘我的工作精神使我獲益匪淺，終生受益。在此，謹(jǐn)向?qū)熤乱宰钫\(chéng)摯的敬意與最衷心的感謝！</p><p>　　同時(shí)感謝王老師在實(shí)驗(yàn)期間給予的幫助，為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了很大的支持與協(xié)助。在此致以衷心的感謝！感謝實(shí)驗(yàn)室的每位成員！</p><p>