湖北山藥主要成分分析及山藥多酚氧化酶的研究.pdf

1、山藥（Dioscorea Opposita）是一種藥食兼用的食材，但因其化學(xué)成分差異和易褐變特性而給加工帶來(lái)困難。本文通過(guò)對(duì)湖北恩施鐵棍山藥、襄陽(yáng)菜山藥、武穴佛手山藥進(jìn)行實(shí)地考察和成分測(cè)定，比較其成分含量的不同，選擇適合加工的山藥品種。針對(duì)山藥加工環(huán)節(jié)易褐變的特性，以菜山藥作為原料，采用緩沖液浸提粗酶液、60％-70%濃度段硫酸銨沉淀、透析除鹽、超濾離心濃縮、高速離子型交換層析、葡聚糖凝膠柱層析的方法純化多酚氧化酶，并用非變性聚丙烯酰胺

2、凝膠電泳結(jié)合活性染色及變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗(yàn)多酚氧化酶純化效果，研究多酚氧化酶的組成、結(jié)構(gòu)特性和酶學(xué)特性。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）恩施、武穴和襄陽(yáng)三種產(chǎn)地的山藥中，武穴佛手山藥各種主營(yíng)養(yǎng)成分的含量都更充足，但是從功能性成分和礦質(zhì)元素含量上看，武穴山藥稍遜于恩施山藥。恩施山藥的基礎(chǔ)性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量和礦物質(zhì)含量明顯比襄陽(yáng)山藥高，水分含量較低，且活性黃酮含量最高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較顯著，故武穴佛手山藥和恩施鐵棍山藥適合作為干制加工原料，

3、而襄陽(yáng)菜山藥多酚含量最高，容易褐變，且水分含量也高，適合作為泡菜和罐頭類的加工原料。
　?。?）襄陽(yáng)菜山藥易褐變，其多酚氧化酶分離純化的最佳條件為：在4℃條件下勻漿浸提9小時(shí)，取60%-70%濃度段的硫酸銨沉淀，透析除鹽、超濾濃縮后，經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephacryl S100丙烯葡聚糖凝膠柱層析分離純化，得到比活力達(dá)8083.63 U/mg的目標(biāo)蛋白，該酶被純化了30倍，經(jīng)Nati

4、ve-PAGE非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS-PAGE變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定確定多酚氧化酶為分子量49.8kDa的二聚體蛋白，單體分子量約為25kDa。
　?。?）純化的多酚氧化酶經(jīng)質(zhì)譜鑒定，匹配度最高的蛋白為山藥儲(chǔ)存蛋白（Dioscorin5 OS），匹配度為72.7%，分子量為31085 Da，等電點(diǎn)6.32。經(jīng)圓二色譜鑒定，山藥多酚氧化酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋占3.9%，β-折疊占54.3%，β-轉(zhuǎn)角占21.3%，無(wú)規(guī)卷

5、曲占20.5%。由粒徑測(cè)定結(jié)果可知，溶液狀態(tài)下的蛋白呈現(xiàn)出天然的聚集狀態(tài)。由熒光光譜測(cè)定結(jié)果可知，山藥多酚氧化酶的色氨酸殘基埋藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部。
　?。?）酶學(xué)特性研究表明：山藥多酚氧化酶的最適底物為鄰苯二酚；最適測(cè)定溫度為35℃；在溫度25-35℃時(shí)酶活較高，高于45℃以后，酶活性迅速減弱；最適測(cè)定pH為7.0；當(dāng)緩沖液pH在6.5-7.5左右時(shí)，酶活性可以保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)；抗壞血酸和亞硫酸鈉在很低濃度時(shí)即對(duì)多酚氧化酶有明顯的抑